[發(fā)明專利]雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610864434.5
• 申請(qǐng)日: 2016-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN106282379B
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 文秦超;荊慧芳;黎樹;張修月;宋昭彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6858
• 代理公司: 成都環(huán)泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 51242
• 代理人: 鄒翠;李斌

本發(fā)明提供了一種雜交黃顙魚的CH₄酶切鑒定方法，利用PCR擴(kuò)增后的CH₄基因片段在黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間具有種間序列差異，以限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鑒別黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種和純種進(jìn)行區(qū)分，具有實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡便，鑒定直觀，無需測序的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及魚類雜種的鑒定方法，具體涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖黃顙魚雜種的CH₄分子標(biāo)記鑒定方法。

背景技術(shù)

黃顙魚屬魚類屬于雜食性底層魚類，以肉食為主，是魚類進(jìn)化中最發(fā)達(dá)的真骨魚類之一。黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)和瓦氏黃顙魚 (Pelteobaggrus vachelli)均屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚屬，兩者味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，是重要的養(yǎng)殖魚類。黃顙魚分布于我國長江、黃河、珠江及黑龍江、遼寧等流域，喜棲息于開敞水體，營底棲生活，灣沱、河底礫石河段都適合它們棲息，1～2齡魚生長較快，以后生長緩慢，其個(gè)體小、但對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)。瓦氏黃顙魚分布于長江、珠江、錢塘江、淮河、黃河及其支流，長期與大型河流相通的大型湖泊中也有分布，為底棲性魚類，棲息于江河緩流或湖泊靜水環(huán)境中，1～3齡魚生長快，之后相對(duì)緩慢，其個(gè)體在黃顙魚屬中最大，且肉質(zhì)細(xì)嫩、刺少，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

為了滿足社會(huì)生產(chǎn)的需要，獲得兼有以上兩種魚優(yōu)良性狀的苗種，王衛(wèi)民等(黃顙魚♀與瓦氏黃顙魚♂的雜交研究[J].淡水漁業(yè)，2002.32(3):3-5) 開展了黃顙魚和瓦氏黃顙魚的雜交育種試驗(yàn)，對(duì)雜交和自交的卵受精率、孵化率和出苗率進(jìn)行了對(duì)比分析。之后趙文學(xué)等(黃顙魚屬物種的RAPD分子鑒定及雜種遺傳分析[J].2006.30(1):101-105)進(jìn)行了黃顙魚屬及其雜交種的種質(zhì)鑒定，然而，該鑒定工作所采用的RAPD標(biāo)記，受方法本身的限制，檢測效率低且重復(fù)性不高，嚴(yán)重影響了這一方法的推廣使用。鑒于此，有必要豐富黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代的分子標(biāo)記及鑒定技術(shù)，為黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜種的養(yǎng)殖和育種實(shí)踐提供參考。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了鑒定黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種(本發(fā)明涉及的雜交種均為♀黃顙魚X瓦氏黃顙魚♂所產(chǎn)生的雜交種)，提供了一種雜交黃顙魚的CH₄酶切鑒定方法，從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種和純種進(jìn)行區(qū)分。

本發(fā)明以黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代為研究對(duì)象，在黃顙魚屬魚類中篩選了CH₄基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用CH₄基因片段的RFLP分析，成功鑒定了黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

雜交黃顙魚的CH₄酶切鑒定方法，利用PCR擴(kuò)增后的CH₄基因片段在黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間具有種間序列差異，以限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鑒別黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。

CH₄基因片段是免疫球蛋白重鏈編碼基因外顯子的一部分，在近緣種間高度保守。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CH₄基因片段在黃顙魚與瓦氏黃顙魚之間存在種間序列差異，將CH₄基因片段的RFLP分析用于黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代的鑒定，具有實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡便，鑒定直觀，無需測序的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明所述雜交黃顙魚的CH₄酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：

A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；

B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

C、對(duì)擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；