[發明專利]用于檢測細胞角蛋白19片段的化學發光免疫試劑盒

有效

• 申請號: 201610863945.5
• 申請日: 2016-09-29
• 公開（公告）號: CN106483298B
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 陳立國;鄒偉權;張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙)11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明屬于醫療檢測領域，具體涉及一種用于檢測細胞角蛋白19片段的化學發光免疫試劑盒及其制備方法。

背景技術

肺癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤，其發病率以每年3％的速度上升。近年來對肺癌的治療雖然取得很大進展，但效果仍不理想，其5年生存率仍在20％～30％，而中晚期癌治療效果更差。研究表明，早期診斷率是提高生存率的關鍵所在，而目前所用標志物在敏感性、特異性方面還不能達到要求。

細胞角蛋白19片段(cyfra21-1)是一分子量為40×10³的酸性蛋白質，是上皮細胞骨架的一部分，在惡性上皮細胞中，激活的蛋白酶加速了細胞角蛋白的障礙，使得大量細胞角蛋白片段釋放入血，尤其是cyfra21-1在肺癌中含量豐富，其與CEA和NSE聯合檢測對肺癌的鑒別診斷，病情監測有重要價值。Cyfra21-1對乳腺癌，膀胱癌，卵巢癌也是很好的輔助診斷和治療監測指標。還應與其他有關的腫瘤標志物聯合檢測，以同時提高臨床診斷的特異性和靈敏度。

對Cyfra21-1的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶聯免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用I等放射性元素標記，檢測設備復雜，必須用專門的儀器測定，其放射性核素的半衰期短，不能長期保存，同時也給實驗操作人員帶來了放射性傷害。ELISA檢測靈敏度不夠高，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不能滿足臨床的要求，因此，化學發光免疫分析方法(CLIA)應運而生。

磁性微球作為體外診斷的固相載體，起到識別、捕獲、控制與運輸目標待檢分子的載體作用。由于其在整個反應過程中均是懸浮在待檢樣本中，與傳統的多孔板載體相比，其整個反應基本處于液態或準液態狀態，載體與待檢物之間發生分子碰撞的幾率大大增加。另外，由于磁性微球較大的表面積提高了負載目標待檢分子的效率，因而使得其生物反應效率較傳統多孔板方式大為提高；一般多孔板上的生物反應需要在1～3小時之間，而基于磁性微球的生物反應僅需十幾分鐘。另外，由于磁性微球卓越的超順磁特性，使得采用全自動磁性分離方式與檢測可以輕松地實現。

專利CN200710121167公開一種細胞角蛋白19片段的化學發光免疫分析方法，但是其仍然是將相關抗體固定在傳統的多孔板上進行相關檢測。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有Cyfra21-1磁分離試劑，酶標記的Cyfra21-1抗體溶液，標準品，洗滌液以及化學發光底物溶液。

所述Cyfra21-1磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球，0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。

所述酶標記的Cyfra21-1抗體溶液是含有1mg/ml辣根過氧化酶標記的抗Cyfra21-1單克隆抗體和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。

所述標準品為不同濃度的Cyfra21-1標準品溶液，其分別含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1標準品的50mmol/l PBS緩沖液，pH7.4。

洗滌液由在濃度為20mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入1％的Tween-20配制而成。

所述化學發光底物溶液分為發光底物A溶液和發光底物B溶液；發光底物A為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為5.0mg/mL的魯米諾，所述發光底物B為是pH值為4.5的0.1M檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100mg/mL的過氧化氫和15mg/mL辣根過氧化氫酶。

本發明的另一個目的是提供所述試劑盒的制備方法，具體步驟如下：

1)Cyfra21-1磁分離試劑的制備：采用化學交聯法將Cyfra21-1單克隆抗體和磁性微球偶聯，磁性微球直徑在1.0μm左右，制備后用PBS緩沖液沖洗三次，然后用1％的BSA溶液封閉3小時，磁性分離微球，用PBS緩沖液沖洗三次，然后用50mmol/L的PBS緩沖液重新懸浮，加入終濃度0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200，調pH值至7.4即得；