[發(fā)明專利]開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑及其合成方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610828240.X
• 申請(qǐng)日: 2016-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN106632266A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尤進(jìn)茂;呂政賢;路帥敏;竇昆;孫志偉;李國(guó)梁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曲阜師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07D403/04
• 分類號(hào): C07D403/04;G01N21/64
• 代理公司: 青島發(fā)思特專利商標(biāo)代理有限公司37212
• 代理人: 王燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記試劑，具體涉及一種開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

在硫醇化合物的高效液相色譜分析中，馬來酰亞胺類熒光標(biāo)記試劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：(1)與傳統(tǒng)的芳基鹵化物、苯并呋喃磺酰鹵等試劑相比，它們與硫醇反應(yīng)速度快，在室溫及生理pH下即可進(jìn)行。(2)對(duì)巰基的選擇性高，加成產(chǎn)物比較穩(wěn)定。(3)自身無熒光或熒光很弱，在與硫醇加成后熒光增強(qiáng)，這種熒光開關(guān)效應(yīng)極大地降低了檢測(cè)過程中的背景信號(hào)干擾。

然而目前可應(yīng)用的馬來酰亞胺類熒光標(biāo)記試劑數(shù)量有限，并且與硫醇加成產(chǎn)物熒光開關(guān)效應(yīng)不明顯，合成步驟復(fù)雜，因此有必要開發(fā)一種標(biāo)記反應(yīng)迅速、熒光開關(guān)效應(yīng)好、合成方法簡(jiǎn)便的開關(guān)型馬來酰亞胺類熒光標(biāo)記試劑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種標(biāo)記反應(yīng)迅速、對(duì)硫醇選擇性高、無背景干擾、合成方法簡(jiǎn)便的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑；本發(fā)明同時(shí)提供其合成方法和應(yīng)用。

本發(fā)明所述的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑是以咔唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，馬來酰亞胺為反應(yīng)活性基團(tuán)，其化學(xué)名為：N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式是：

所述的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑的合成方法，包括以下步驟：

(1)將順丁烯二酸酐溶解到乙腈中，常溫下滴加含有3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢，除去溶劑，得到中間體N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸；

(2)用乙酸酐將N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸溶解，加入無水乙酸鈉進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢冷卻，再倒入水中淬滅反應(yīng)，回收固體后，經(jīng)干燥、重結(jié)晶得到目標(biāo)產(chǎn)物N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺。

其中：

步驟(1)中順丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑的摩爾比為1.1～1.4:1。

步驟(1)中滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)0.8～1小時(shí)。

步驟(1)中反應(yīng)完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。

步驟(2)中無水乙酸鈉與N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰胺酸的摩爾比為1:5～8。

步驟(2)中加入無水乙酸鈉后，在100℃下反應(yīng)0.8～1小時(shí)。

步驟(2)中采用乙腈重結(jié)晶三次。

所述的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑的應(yīng)用，即檢測(cè)硫醇濃度的方法，包括如下步驟：

(1)配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液；配制5份硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液，濃度分別為1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制濃度為100mM的N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的乙腈溶液；

(2)依次將50μL PBS緩沖溶液、100μL硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反應(yīng)10分鐘，反應(yīng)完畢后，取10μL進(jìn)入高效液相色譜儀中分析，設(shè)置熒光激發(fā)波長(zhǎng)為274nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為363nm，得到硫醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，以硫醇濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制硫醇濃度工作曲線；

(3)將樣品用開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記后，進(jìn)入高效液相色譜儀中分析，將所得到的峰面積代入硫醇濃度工作曲線中，即可求得樣品中硫醇的濃度。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明的開關(guān)型硫醇熒光標(biāo)記試劑是以咔唑?yàn)闊晒鈭F(tuán)，馬來酰亞胺為反應(yīng)活性基團(tuán)，其中馬來酰亞胺環(huán)與咔唑熒光團(tuán)直接相連，由于馬來酰亞胺環(huán)的強(qiáng)吸電子效應(yīng)，使標(biāo)記試劑的量子產(chǎn)率顯著下降，表現(xiàn)為無熒光。

本發(fā)明試劑自身不發(fā)熒光，可在中性條件下選擇性地與硫醇化合物反應(yīng)，生成具有強(qiáng)熒光的衍生產(chǎn)物，極大地降低硫醇檢測(cè)過程中的背景干擾；標(biāo)記反應(yīng)具有高選擇性，在生理pH值下只和硫醇發(fā)生反應(yīng)；標(biāo)記反應(yīng)速度快，對(duì)硫醇的標(biāo)記反應(yīng)可在10分鐘內(nèi)完成；標(biāo)記試劑合成步驟簡(jiǎn)單，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，產(chǎn)率較高，經(jīng)分離提純后，化學(xué)純度達(dá)99.6％以上，具有標(biāo)記反應(yīng)速率快、標(biāo)記產(chǎn)率高、對(duì)硫醇選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，有利于增強(qiáng)硫醇類化合物分析的準(zhǔn)確性和靈敏性，可應(yīng)用于生命分析、環(huán)境分析、食品分析等研究領(lǐng)域中，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的合成路線圖。

圖2是實(shí)施例1N-(9-乙基-咔唑)-馬來酰亞胺的核磁¹HNMR圖。

圖3是實(shí)施例2試劑和其硫醇衍生物的熒光發(fā)射圖。

圖4是實(shí)施例3試劑與巰基化合物的反應(yīng)路線圖。

圖5是實(shí)施例3試劑衍生5種硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。

具體實(shí)施方式