[發明專利]一種用于分析大豆種質遺傳完整性的方法

有效

• 申請號: 201610801333.3
• 申請日: 2016-09-05
• 公開（公告）號: CN106399491B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 王棟;張曉冬;李潤芳;李湛;李群;田茜;戴雙;丁漢鳳;王效睦;谷曉紅
• 申請（專利權）人: 山東省農作物種質資源中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 朱彩霞

1.一種用于分析大豆種質遺傳完整性的方法，其特征是，采用形態標記分析與SSR標記分析相結合：對大豆不同生活力群體及其后代群體單株進行農藝性狀調查，計算出形態多樣性指數，并進行顯著性差異分析；利用SSR核心引物組對各群體單株的DNA進行擴增檢測，計算出不同生活力群體及其后代群體與對照群體之間的各位點等位基因頻率、每位點等位基因數、遺傳多樣性指數和香農指數，對各處理群體與對照群體之間的各位點等位基因頻率進行χ²檢驗，對每位點等位基因數、遺傳多樣性指數和香農指數進行顯著性t檢驗；所述形態標記分析與SSR標記分析在同一群體同一單株上進行；

所述SSR標記分析的分析樣本的采集是在不同生活力親代群體及其子代群體在田間繁殖更新期間，子代采集葉片的單株與其親代是一一對應關系；

所述SSR核心引物組由20個引物對組成：序列分別如SEQ ID No.1-SEQ ID No.40所示；

所述不同生活力群體的獲得方法是采用人工倒序老化的方法，包括如下步驟：選取播種、田間管理、收獲及成熟度一致的大豆種子，先放入人工氣候箱中進行種子含水量平衡，平衡條件是45％RH，25℃，15天，使處理種子的含水量處于同一水平；然后用鋁箔袋真空密封分裝，放置于人工老化箱內40℃恒溫老化；放置順序采用倒序法，即人工老化時間最長的處理先放入進行老化，人工老化時間最短的最后放入進行老化，試驗結束時一起取出；人工老化結束后在25℃下，將所有處理密封平衡2天。

2.如權利要求1所述的用于分析大豆種質遺傳完整性的方法，其特征是，所述形態標記分析：從不同生活力群體及其子代群體中選出30個單株，每個單株分別調查形態性狀；形態性狀多樣性的計算采用Shannon-Weaver指數，將各群體的Shannon-Weaver指數與對照群體進行顯著性t檢驗，若差異不顯著則認為種質遺傳完整性得到有效保持，若差異達到顯著或極顯著水平，則認為種質遺傳完整性發生了改變；

所述SSR標記分析：從不同生活力群體及其子代群體每個群體中選取96個單株進行；所述96個單株中包括進行所述形態標記分析的30個單株。

3.如權利要求2所述的用于分析大豆種質遺傳完整性的方法，其特征是，所述SSR標記分析，步驟如下：

(1)采用SDS法單株提取大豆不同生活力群體及其子代群體的葉片基因組DNA，樣本量為96株，包括形態性狀調查的30株；

(2)以基因組DNA為模板，用SEQ ID No.1-SEQ ID No.40所示20對SSR核心引物進行PCR擴增；

(3)采用6％聚丙烯酰氨凝膠電泳分離擴增產物，電泳結束后銀染法檢測；

(4)統計擴增譜帶類型，每個引物視為1個位點，每條帶視為1個等位變異；參照DL1000DNA Marker估計片段大小；利用POPGENE version1.31和Powermarker V3.25軟件對大豆不同生活力群體及其子代群體進行遺傳結構分析，計算出各個群體的各位點等位基因頻率、每位點等位基因數、遺傳多樣性指數和香農指數，并利用SAS9.1對各處理群體與對照群體之間的各位點等位基因頻率進行χ²檢驗，對每位點等位基因數、遺傳多樣性指數和香農指數進行顯著性t檢驗，如果差異不顯著則認為種質遺傳完整性得到有效保持，如果差異達到顯著或極顯著水平，則認為種質遺傳完整性發生了改變。

4.如權利要求3所述的用于分析大豆種質遺傳完整性的方法，其特征是，所述PCR擴增反應程序為：94℃預變性4min；95℃變性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸10min。

5.一種用于分析大豆種質遺傳完整性的試劑或試劑盒，其特征是，包括權利要求1所述20對SSR引物。