[發明專利]視黃醇結合蛋白檢測試劑的包被方法

有效

• 申請號: 201610788758.5
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN106383234B
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 陳瑞;李基;胡振華
• 申請（專利權）人: 上?？迫A生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙)31260
• 代理人: 成麗杰

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種視黃醇結合蛋白檢測試劑R2的包被方法。

背景技術

視黃醇結合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP)為血液中視黃醇(維生素A)的轉運蛋白。在幾十年研究中，人們對這種蛋白質的分子結構、生物學特性等逐漸了解，發現這種蛋白質廣泛地分布于正常人體液中，屬α1-球蛋白，具有從肝細胞中轉運視黃醇至周圍組織的功能?，F認為血液中RBP主要以視黃醇、前白蛋白結合的復合物形式存在，當復合物中視黃醇與靶細胞結合后，RBP便與前白蛋白分離，自腎小球濾出，由近端腎小管上皮細胞吸收、降解。近年來的深入研究表明RBP含量的改變能夠敏感地反映近端腎小管功能、肝功能損害程度，是反映腎臟、肝臟及營養性疾病發展、轉歸的敏感指標。

研究發現，視黃醇結合蛋白廣泛分布于血液、尿液、腦脊液及其他體液中，其正常值：線性范圍：血清：0.5～140ug/ml，尿液：0.1～18ug/ml，參考值：血清：25～70ug/ml，尿液：<0.7ug/ml。目前，測定血、尿中的視黃醇結合蛋白檢測方法有很多，比如酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)，但是ELISA方法雖然在臨床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺點，定量準確性差、操作時間長、自動化程度低，一般只能用于定性檢測。RIA靈敏度高，但不穩定，重復性比ELISA差，而且存在放射性污染的危險。因此，尋找更加穩定、準確的視黃醇結合蛋白檢測方法一直是國際上近十年來的研究熱點。

膠乳增強免疫比濁法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年來出現的一種比較穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁法。其中，PEITA法大體分為兩種：1、散射比濁法，2、透射比濁法。兩種方法的基本原理非常相似，都是在高分子納米膠乳微球的表面交聯抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合后，在短時間會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性或透光性能。而且，反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性，在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。納米膠乳增強免疫比濁法操作步驟的簡化相應的避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的干擾，穩定性和重復性都比較好，能真實地反映被測物質的含量。目前，視黃醇結合蛋白檢測試劑(膠乳增強法)的包被方法主要有物理方法、化學方法，其中，物理吸附主要靠氫鍵，靜電等作用結合在一起，抗體與納米膠乳微球結合不牢固，容易脫落，化學方法使納米膠乳微球與抗體通過化學共價鍵結合，結合力強，不易脫落，化學方法主要包含又分為兩種：一步法、兩步法。一步法簡單方便省時，但存在抗體偶聯效率低、偶聯試劑易失活的問題，而兩步法，交聯效率雖然很高，但是存在操作繁瑣、費時的問題。

綜上所述，提供一種抗體偶聯效率高的一步法包被視黃醇結合蛋白檢測試劑是目前我們亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種視黃醇結合蛋白檢測試劑的包被方法，使得抗體偶聯效率更高，且方法簡單、方便。

為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種視黃醇結合蛋白檢測試劑的包被方法，該方法包含以下步驟：向納米膠乳微球加入交聯緩沖液進行稀釋，加入交聯劑后進行攪拌；在攪拌的過程中加入視黃醇結合蛋白抗體、十二烷基硫酸鈉-聚乙烯吡咯烷酮溶液進行交聯，交聯后進行離心、超聲分散清洗，再離心即得離心沉淀物；向離心沉淀物中加入視黃醇結合蛋白檢測試劑R2的稀釋液，超聲分散后，即得包被的視黃醇結合蛋白檢測試劑R2。

本發明實施方式相對于現有技術而言，通過在一步法中添加十二烷基硫酸鈉-聚乙烯吡咯烷酮，加入十二烷基硫酸鈉-聚乙烯吡咯烷酮的目的可以使抗體在交聯體系中充分分散，長鏈的聚乙烯吡咯烷酮使視黃醇結合蛋白抗體間隔偶聯到納米膠乳微球上，且豎直伸向外圍溶液，更方便與抗原結合，再加上十二烷基硫酸鈉-聚乙烯吡咯烷酮的存在可以促使交聯劑的水解失活速度降低，促進了抗體與納米膠乳微球的偶聯效率。使得一步法反應得到產物的性能接近兩步法反應得到產物的性能。另外，與兩步法相比，一步法步驟簡單、方便，節約了工作時間，提高了工作效率。

另外，交聯劑為碳二亞胺鹽酸鹽或者N-羥基硫代琥珀酰亞胺。

另外，碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為5～15mg/ml；N-羥基硫代琥珀酰亞胺的濃度為50～150mg/ml。根據納米膠乳微球表面的功能基團摩爾數確定交聯劑含量，保證了納米膠乳微球表面功能基團的充分活化。