[發明專利]在果蠅細胞中高表達人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制備方法

有效

• 申請號: 201610771314.0
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN106399336B
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 周智廣;鄭沛林;黃干;謝志國;易波
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅二醫院
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/85
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所43114
• 代理人: 袁靖

1.編碼在果蠅細胞中高表達的人GAD65蛋白的基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.人GAD65蛋白的制備方法，其特征在于，將權利要求1所述基因的如SEQ ID NO.1所示的序列聯合StrepII標簽克隆到表達載體中，再和抗性質粒同時轉染到果蠅細胞中表達，將得到GAD65-StrepII標簽融合蛋白。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表達載體為pAc5.1/V5-HisA。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗性質粒為pCoBlast抗性載體。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述果蠅細胞為S2。

6.根據權利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)根據種屬偏好性表達，運用軟件對人GAD65的ORF序列進行密碼子優化；

(2)人工合成全序列；

(3)引物和酶切位點設計：

根據合成的序列和StrepII標簽設計引物，并加入KpnI和NotI酶切位點，引物如下所示：

forward primer：

5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCCTCGCCAGGAAGCGG-3'；

reverse primer：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGGTCCTGGCCCAGG-3’；

(4)PCR擴增獲得目的GAD65-StrepII片段；

(5)對目的片段和載體進行雙酶切；

(6)酶切后的目的片段和載體在T4連接酶作用下連接；

(7)重組轉化:將重組表達載體轉染細菌感受態細胞；

(8)測序驗證后大量抽提表達GAD65-StrepII的載體；

(9)將GAD65-StrepII載體與pCoBlast抗性載體共轉染果蠅細胞表達蛋白；

(10)步驟(9)獲得的蛋白經過純化后獲得高純度GAD65蛋白。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(5)中的載體為pAc5.1/V5-HisA。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(6)利用連接酶進行重組連接：連接片段100ng，加入50ng酶切后的pAc5.1/V5-His A質粒，5μl 2×反應buffer和1μl T4連接酶，補足水到10μl；在22℃連接1h，轉化感受態細胞。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(9)的具體過程：

選取培養好的健康的S2細胞，將3×10⁶個細胞接種在60mm組織培養皿中，培養基為針對S2細胞的Sf-900II SFM Medium，每皿加入3ml的培養基，28℃無菌條件下在恒溫培養箱中進行培養；

使用磷酸鈣轉染試劑盒K2780-01進行細胞轉染:

①在無菌1.5ml的離心管中依次加入雙蒸水233μl，氯化鈣240mM 36μl，1μg/μl GAD65-StrepII-pAc5.1/V5-His A質粒19μl，0.5μg/μl pCoBlast質粒2μl；

②緩慢混合1min后轉移到含有200μl的2×HEPES HBS的離心管中，混勻；

③將混合物在室溫放置30-40min；

④緩慢將混合物加入到細胞培養基中，緩慢旋轉培養皿以充分混勻；

⑤在28℃的恒溫培養箱中培養1天；

⑥對細胞培養基進行換液；

⑦將培養基連同細胞一起吸入15ml的離心管中；

⑧1000rpm離心3min后，去除上清，并加入1ml新鮮培養基到15ml的離心管中；

⑨將混合物重新加入到新的離心管中；

⑩用2ml培養基重新清洗一次；

用2ml培養基懸浮細胞，并轉到培養皿中培養；

28℃培養兩天后加入20μg/ml Blasticidin篩選克隆建立穩定轉染細胞系。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(9)轉染后的細胞培養在含20μg/ml Blasticidin的Sf-900II SFM Medium中，分為10個細胞三角培養瓶，每瓶200ml培養基培養；細胞培養物收集裂解后，再通過StrepII標簽親和純化色譜靶向獲得。