[發明專利]一種特異性結合新城疫病毒的核酸適配體及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201610719675.0
• 申請日: 2016-08-24
• 公開（公告）號: CN107058329B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 任濤;譚陽通;謝鵬;高瀟祎;王峰
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/569
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 張燕玲;楊曉松

本發明公開了一種特異性結合新城疫病毒的核酸適配體及其篩選方法和應用。所述核酸適配體是利用SELEX技術篩選獲得的特異性適配體B53。具體地，是在體外構建合成隨機單鏈DNA文庫和引物，以原核表達的新城疫HN蛋白和新城疫病毒GM株為靶分子，經過篩選、PCR擴增、正向和反向篩選，將篩選得到的特異性結合新城疫病毒GM株的單鏈DNA文庫進行克隆測序，得到特異性適配體B53。該適配體B53具有抑制病毒復制、病毒血凝活性和形成蝕斑的能力，能夠特異性識別新城疫病毒HN蛋白和新城疫病毒GM株，而對禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒和SPF雞胚尿囊液無反應性，可用于檢測新城疫病毒。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，更具體地，涉及一種特異性結合新城疫病毒的核酸適配體及其篩選方法和應用。

背景技術

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一種高度接觸性、致死性的烈性傳染病，禽類感染后以呼吸道、消化道和中樞神經系統損傷為主要特征。NDV屬于副黏病毒科，為單股、不分節段、有囊膜的負鏈RNA病毒，基因組結構為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，編碼6種結構蛋白，目前只有一個血清型。該病呈世界性分布，給養禽業造成了巨大的經濟損失。對于多數國家養禽業，不僅因暴發新城疫導致巨大的經濟損失，而且控制本病成本較高。免疫接種是預防新城疫的有效手段，但需要反復監測，成本較高。

核酸適配體，也稱適配子或適配體，作為“化學抗體”，能夠特異性識別和結合靶分子。1990年，Tuerk利用體外篩選技術獲得能與T4DNA聚合酶特異性結合的RNA，并把該技術定義為指數富集的配體系統進化技術(Systematic Evolution ofLigands byExponential Enrichment，SELEX)。同年，Ellington發現了能與小分子有機染料結合的RNA片段，將其命名為核酸適配體(Aptamer)。適配體是一段具有特定三維構象的單鏈寡核苷酸，長度一般在60～100nt，通過指數富集的配體系統進化技術，從人工合成的隨機核苷酸序列文庫中經過多輪篩選分離，獲得能與靶分子高特異性和高親和力結合的寡核苷酸序列。適配體是以其穩定的三維構象為基礎，主要包括發夾結構、莖、三重體、假結體和G-四聯體。通過自身構象變化和三維折疊形成能與靶分子特異性結合的位點。核酸分子在儲存、運輸、處理和表達遺傳信息的生物過程中發揮重要作用，而適配體因其與靶分子分子具有特異性親和識別的性質，拓寬了人們對核酸作為傳統遺傳物質的概念認識。適配體作為“化學抗體”，可作為功能阻斷劑影響病毒的復制和翻譯等過程，進而阻止疾病的發生；此外，適配體也可以替代抗體的特定功能，用 于相關病毒病的檢測。近年來，適配體被廣泛作為理想的識別元件用于目標分子的檢測。適配體識別靶物質的模式與傳統的抗體識別模式類似，與傳統的抗體相比，核酸適配體具有更多的優勢，如表1所示。

表1適配體與抗體的特點比較

目前，各種改進的SELEX篩選方法層出不窮，至今沒有固定標準。將篩選用的文庫和靶分子按一定比率混合，并選擇合適的條件(介質、溫度、緩沖體系、時間等進行孵育)，該步驟雖然簡單，但是不同條件會影響篩選的效率與配基的親和力。如何獲得具有更高特異性和親和力的適配體，剔除非特異性序列和特異性較差的序列，提高篩選的效率是亟待努力解決的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有蛋白抗體的技術不足，提供一種具有與靶分子高親和力、高特異性結合、易獲得、其過程不依賴動物、細胞和內環境、制備周期短，成本低、比抗體更穩定，重復性好的特異性結合新城疫病毒的核酸適配體。

本發明另一個目的是提供上述核酸適配體的篩選方法。

本發明再一個目的是提供上述核酸適配體在檢測新城疫病毒中的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：