[發(fā)明專利]豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、變異株和疫苗株多重RT?PCR檢測試劑盒及其引物組

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610718584.5
• 申請日: 2016-08-24
• 公開（公告）號: CN106636456A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 施開創(chuàng);胡杰;粟艷瓊;尹彥文;屈素潔;陸文俊;李軍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于RT-PCR檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、變異株和疫苗株多重RT-PCR檢測試劑盒及其引物組。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種急性、高度傳染的病毒性傳染病，其主要特征是懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各種年齡豬、特別是仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病。該病病原PRRS病毒(PRRSV)可以分為歐洲型(基因I型)毒株(EU-PRRSV)和美洲型(基因II型)毒株(NA-PRRSV)。我國PRRSV流行毒株以NA-PRRSV經(jīng)典株、高致病性變異株為主，但在部分省份也檢測到EU-PRRSV。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好的豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、變異株和疫苗株多重RT-PCR檢測試劑盒及其引物組，可同時檢測并區(qū)分PRRSV野毒株、疫苗株。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、變異株和疫苗株多重RT-PCR檢測引物組，包括兩對特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1∶1∶1∶1。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、變異株和疫苗株多重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有以下試劑：反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、滅菌雙蒸水，PCR反應(yīng)液包括兩對特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。

反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液每管15μL，包括：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP1.0μL含各dNTP 10mM，隨機引物6聚體50pmol/μL、1.5μL，RNA酶抑制劑40U/μL、0.5μL，RNase H-型反轉(zhuǎn)錄酶200U/μL、1.0μL，滅菌雙蒸水7μL；PCR反應(yīng)液每管45μL，包括：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物1至425pmol/μL各1.0μL，滅菌雙蒸水16μL。

針對目前豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測存在的問題，根據(jù)NA-PRRSV經(jīng)典株(C-PRRSV)與變異株(HP-PRRSV)在Nsp2基因的序列差異(變異株在Nsp2基因共缺失90個核苷酸)以及TJM-F92疫苗株(V-PRRSV)在Nsp2基因的序列特點(在缺失90個核苷酸的基礎(chǔ)上還另外連續(xù)缺失360個核苷酸)，由此，發(fā)明人設(shè)計了豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株、變異株和疫苗株多重RT-PCR檢測引物組，包括兩對特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。其中，引物1和2(B2-F/B2-R)用于區(qū)分美洲型經(jīng)典株、變異株，引物3和4(TJM-F/TJM-R)用于區(qū)分野毒株和TJM-F92株，可實現(xiàn)三種不同類型毒株的鑒定在同一個擴增反應(yīng)中一次性完成。據(jù)此，發(fā)明人還制備了檢測試劑盒，并建立了相應(yīng)的多重RT-PCR檢測方法，該法可以特異檢測PRRSV，而與豬的其他重要病原無交叉反應(yīng)；對重組質(zhì)粒標準品的檢出下限為1.13×10³拷貝。臨床檢測結(jié)果表明，本發(fā)明具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好等特點，可同時檢測并區(qū)分PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株及TJM-F92疫苗株，為臨床快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)平臺。

附圖說明

圖1是多重PCR特異性試驗結(jié)果圖，圖中：M 2000bp DNA分子質(zhì)量標準，1四種重組質(zhì)粒混合物，2 CH-1R，3 HuN4-F112，4 TJM-F92，5 PCV2，6 PRV，7 FMDV，8 CSFV，9陰性對照。

圖2是多重PCR敏感性試驗結(jié)果圖，圖中：M 2000bp DNA分子質(zhì)量標準，1-9質(zhì)粒濃度分別為1.13×10⁹-1.13×10¹拷貝/μL，10陰性對照。

圖3是多重PCR重復(fù)性試驗結(jié)果圖，圖中M 2000bp DNA分子質(zhì)量標準，1-6相同條件下的6次重復(fù)反應(yīng)。

具體實施方式