[發明專利]高糖基化人凝血因子VIII融合蛋白及其制備方法與用途

有效

• 申請號: 201610692838.0
• 申請日: 2016-08-19
• 公開（公告）號: CN106279437B
• 公開（公告）日: 2017-10-31
• 發明（設計）人: 李強;朱文臣;李媛麗;朱成功;高永娟;任子甲;朱鹿燕;孫乃超;王曉山;劉賓;李智;王文文;姜明;王齊磊;王莉蕊;王淑亞;朱松林;高潔;蘇鴻聲
• 申請（專利權）人: 安源醫藥科技（上海）有限公司;輔仁藥業集團有限公司;旭華（上海）生物研發中心有限公司;開封制藥（集團）有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10;A61K38/37;A61K47/68;A61P7/04
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1.一種人凝血因子VIII的融合蛋白，所述融合蛋白從N端至C端依次包含人凝血因子VIII、柔性肽接頭、至少1個人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽剛性單元和延長半衰期部分；其中，延長半衰期部分選自人免疫球蛋白Fc片段、白蛋白、轉鐵蛋白或PEG；

其中，所述柔性肽接頭具有以(GS)_a(GGS)_b(GGGS)_c(GGGGS)_d循環單元組合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整數，且a+b+c+d≥1；和所述人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基末端肽剛性單元包含以下氨基酸序列：

(i)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(ii)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(iii)SSSSKAPPPS；

(iv)SRLPGPSDTPILPQ。

2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的。

3.如權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通過在哺乳動物細胞中表達而糖基化的。

4.如權利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通過在中國倉鼠卵巢細胞中表達而糖基化的。

5.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人凝血因子VIII的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接頭優選自下組：

(i)GSGGGSGGGGSGGGGS；

(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。

7.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5個人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基末端肽剛性單元。

8.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc片段具有降低的ADCC效應和/或CDC效應，和/或與FcRn受體的結合親和力增強。

9.如權利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段選自：

(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1絞鏈區、CH2和CH3區域；

(ii)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域；

(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域；

(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域；

(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和CH3區域。

10.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

11.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的活性>6000IU/mg。

12.編碼如權利要求1-11中任一項所述的融合蛋白的DNA分子。

13.如權利要求12所述DNA分子，所述DNA分子的序列如SEQ ID NO：17所示。

14.一種載體，其特征在于，包含如權利要求12或13所述的DNA分子。

15.一種宿主細胞，其特征在于，包含如權利要求14所述的載體，或者轉染了權利要求14所述的載體。

16.一種藥物組合物，其特征在于，包含藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效劑量的如權利要求1-11中任一項所述的融合蛋白。