[發(fā)明專利]一種用于評價化合物對病理狀態(tài)下血管生成作用的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610677027.3
• 申請日: 2016-08-16
• 公開（公告）號: CN106370833B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓利文;劉可春;何秋霞;張云;韓建;王榮春;孫晨;王雪;侯海榮;彭維兵;陳維云;陳錫強;張軒銘;李曉彬;張姍姍;楚杰;王希敏;郭敬蘭;黨立
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省科學(xué)院生物研究所
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 濟南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司37219
• 代理人: 張宏松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于評價化合物對病理狀態(tài)下血管生成作用的方法，屬于藥物篩選領(lǐng)域。

背景技術(shù)

血管生成是通過人體中存在的諸多互補和復(fù)雜的信號途徑調(diào)節(jié)的，與很多疾病的發(fā)生和治療有關(guān)。血管生成除可影響腫瘤的發(fā)生外，在其他一些疾病，如視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、子宮內(nèi)膜異位癥等的發(fā)生中也起重要作用。阻止病理狀態(tài)下的血管生成也已經(jīng)成為該類疾病的新途徑。

研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可直接作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激其發(fā)生有絲分裂，從而促進新生血管的生長，是最重要的血管形成因子。VEGF是內(nèi)皮細胞的特異性生長因子，并且是最特異和最關(guān)鍵的血管生成刺激因子，幾乎參與了生理性和病理性血管形成的每一步，可以直接作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激其發(fā)生有絲分裂，從而促進新生血管的生長。結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤細胞均有自分泌VEGF的功能，發(fā)生游走轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞在局部可以釋放VEGF刺激局部血管的形成。VEGF及其受體在多種腫瘤中表達，而在血管生成活躍組織(如腫瘤等)以外較少表達。因此，在腫瘤等病理狀態(tài)下，VEGF高表達是最為重要的病理學(xué)特征。

實驗?zāi)Ｐ褪撬幬镅邪l(fā)的重要環(huán)節(jié)。實驗?zāi)Ｐ偷挠行裕蓻Q定藥物發(fā)現(xiàn)的效率，降低研發(fā)風(fēng)險。目前血管生成的體外研究模型，主要是用體外細胞培養(yǎng)的方法，進行內(nèi)皮細胞培養(yǎng)，觀察其對血管生成的影響。血管生成的體內(nèi)研究模型主要有動物(大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜等動物模型。血管生成的體外模型不能很好地反應(yīng)體內(nèi)所處的復(fù)雜內(nèi)環(huán)境，評價結(jié)果的準(zhǔn)確性較差。血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體，但操作繁瑣，耗時過長。

而新興的實驗動物斑馬魚體現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。斑馬魚具有體積小，產(chǎn)卵量高，發(fā)育成熟時間短，體表富有通透性，飼養(yǎng)條件簡單，易于培養(yǎng)等特點，從而可以縮短藥物篩選的實驗周期，提高篩選效率；減少篩選過程中對受試樣品的需要量，有利于微量先導(dǎo)化合物樣品的活性篩選實驗；可直接將受試藥物投入培養(yǎng)基中進行實驗，能同時進行多水平多因素的篩選。因此，斑馬魚在用于藥物篩選的操作中便捷且經(jīng)濟。同時斑馬魚具有體外受精和個體透明的特征。利用這種特征，可實現(xiàn)在共聚焦顯微鏡下進行活體觀察，既可動態(tài)觀察其胚胎發(fā)育全程以及外源性物質(zhì)對血管發(fā)育的影響，又可進行基因水平上的操作。但是遺憾的是，目前利用斑馬魚模型建立的血管生成模型均為直接觀察新生的血管，是在生理狀態(tài)的血管新生，從嚴(yán)格意義上講，并不能有效區(qū)分正常的血管生成和病理狀態(tài)下的血管生成。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于評價化合物對病理狀態(tài)下血管生成作用的方法，該方法建立在病理狀態(tài)下，可以準(zhǔn)確快速評價藥物對血管的生成。

術(shù)語說明：

完全腸下外緣靜脈長度：腸下外緣靜脈以及腸下外緣靜脈上生出的棘突長度的總和，見圖1。

hpf(hours post fertilization)：生物學(xué)專用術(shù)語，指受精后的時間，如48hpf指受精后48小時的胚胎。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

發(fā)明概述：

本發(fā)明采用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)處理特定時期斑馬魚幼魚，模擬病理狀態(tài)，然后以“完全腸下外緣靜脈長度”作為評價指標(biāo)，成功建立了藥物對病理狀態(tài)血管生成作用的評價方法，具有操作簡單、快速、穩(wěn)定可靠和重復(fù)性好的優(yōu)點。

發(fā)明詳述：

一種用于評價化合物對病理狀態(tài)下血管生成作用的方法，其特征在于，包括步驟如下：

(1)將受精后48h的發(fā)育正常轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎移入培養(yǎng)孔中，加入血管內(nèi)皮生長因子進行處理，得VEGF處理斑馬魚胚胎；將受精后48h的發(fā)育正常斑馬魚胚胎不經(jīng)血管內(nèi)皮生長因子處理為正常斑馬魚胚胎；

(2)一組VEGF處理斑馬魚胚胎連續(xù)給藥孵育至72hpf，作為加藥組，另外一組VEGF處理斑馬魚胚胎加入等量的培養(yǎng)水孵育至72hpf，作為VEGF組，正常斑馬魚胚胎加入培養(yǎng)水孵育至72hpf，作為正常對照組；

(3)麻醉加藥組、VEGF組及正常對照組的斑馬魚，采集每條斑馬魚腸下靜脈(SIVs)區(qū)域的熒光顯微圖像，測量每組每條魚的完全腸下外緣靜脈長度；

(4)定量分析

得到的每組斑馬魚完全腸下外緣靜脈長度以表示，分析比較正常對照組、VEGF組、加藥組之間差異的顯著性；