[發明專利]一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法

在審

• 申請號: 201610657389.6
• 申請日: 2016-08-11
• 公開（公告）號: CN107164256A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 劉萌萌;黃俊潮;葉景潤;趙啟超
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙)53108
• 代理人: 旃習涵

1.一種鞘氨醇單胞菌，保藏號為CGMCC No.12394。

2.一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，包括以下步驟：

(1)構建電擊轉化鞘氨醇單胞菌所需質粒；

(2)制備鞘氨醇單胞菌感受態細胞；

(3)電擊轉化鞘氨醇單胞菌感受態細胞，轉化后培養；

(4)轉化用于遺傳改造效果的驗證。

3.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：步驟(1)中所述電擊轉化鞘氨醇單胞菌所需質粒是由將鞘氨醇單胞菌內源質粒復制子與pHSG398質粒連接所構成。

4.根據權利要求3所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：所述步驟(1)中電擊轉化鞘氨醇單胞菌所需質粒是由將鞘氨醇單胞菌內源質粒或內源質粒上任何長度帶有復制子的DNA片段或基本上同源的一段DNA序列與pHSG398質粒連接所構成。

5.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：所述步驟(2)制備鞘氨醇單胞菌感受態細胞是將鞘氨醇單胞菌接種至LB培養基內，于28℃搖床孵育至吸光度OD_600nm＝0.6-0.9，離心收集，使用預冷的10％甘油洗兩遍，于-80℃凍存。

6.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：所述步驟(3)電擊轉化鞘氨醇單胞菌感受態細胞，采用電擊條件為2.0KV-2.5KV，脈沖時間為4.5-5.5ms。

7.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：所述步驟(3)轉化后培養是向電擊后的鞘氨醇單胞菌感受態細胞加入TB培養基，震蕩培養2-6小時。

8.根據權利要求1所述的一種鞘氨醇單胞菌在對鞘氨醇單胞菌的遺傳改造中的應用，其特征在于將由鞘氨醇單胞菌內源質粒上任意片段或基本同源的一段DNA序列組成的質粒，用于對鞘氨醇單胞菌的遺傳改造。

9.根據權利要求2所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：該方法包括下述步驟：

(一)構建轉化所必須的質粒：

1、鞘氨醇單胞菌內源質粒的提取由常用質粒抽提試劑盒實現，將獲得的內源質粒分別用限制性內切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ進行消化，分別獲得長度為6kb，5kb，3kb的DNA片段，其三者共同特征是都含有內源質粒的復制子；

2、將帶氯霉素抗性的質粒pHSG398分別用限制性內切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ進行消化，與(1)獲得的三種不同大小的DNA片段進行連接，構建得到三種不同大小的的質粒pHSG398‐RepB，pHSG398‐RepE，pHSG398‐RepS；

(二)制備感受態細胞：

1、從4℃冰箱中取出保藏的鞘氨醇單胞菌KIB,挑取至LB液體培養基中，于28℃,220rpm過夜培養15-18小時，活化菌體；

2、用移液槍吸取2.5ml步驟1的培養物在無菌超凈臺接種于50mlTB培養基中，28℃，220rpm振蕩培養至OD600nm＝0.8；

3、將步驟2的菌液冰浴10min后，放入離心管中，4℃/5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞；

4、在無菌超凈臺上用4℃預冷的20ml的10％甘油通過移液槍吹懸步驟3得到的細胞，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞，漂洗2次；

5、在無菌超凈臺上用2ml10％甘油吹懸步驟4得到的細胞，分裝于離心管中，-80℃保存；

(三)電擊轉化

1、取100ng步驟一所構建的三種不同大小的質粒pHSG398‐RepB，pHSG398‐RepE，pHSG398‐RepS，分別加入到步驟二制備的感受態細胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使所述質粒DNA和感受態細胞充分混勻，冰浴2min；

2、將完成步驟1的體系轉移至0℃預冷的1mm電擊杯中，用電轉儀進行電擊，電壓25KV/cm，時間常數＝5ms；

3、完成步驟2后，立即向電擊杯中加入1mlTB培養基，混勻；

4、完成步驟3后，將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，28℃,220rpm振蕩培養2-6小時；

5、將完成步驟4的培養體系涂布于含有終濃度為15μg/ml氯霉素的LB固體培養基平板，28℃培養48小時；

6、隨機挑取生長出來的單克隆，提取質粒瓊脂糖凝膠電泳，驗證轉化結果；

(四)轉化用于遺傳改造效果驗證

1、將步驟一構建得到的pHSG398‐RepS質粒，用SmaⅠ酶切，回收得到的片段與從衣藻中克隆的酮化酶基因BKT連接，得到pHSG398‐RepS‐BKT質粒；

2、將pHSG398‐RepS‐BKT質粒，按步驟三電擊轉化鞘氨醇單胞菌，BKT基因在鞘氨醇單胞菌中表達，鞘氨醇單胞菌由原來的黃色變成了紅色，超高效液相色譜分析，類胡蘿卜素上的紫羅酮環上都加上了羰基，證明鞘氨醇單胞菌轉化系統構建成功。

10.根據權利要求9所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其特征在于：其中所述轉化內源質粒復制子DNA在3233bp-4641bp之間；鞘氨醇單胞菌轉化后回復時間為2-6小時。