[發(fā)明專利]用于檢測(cè)C?KIT基因1675?1681位突變的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610654359.X
• 申請(qǐng)日: 2016-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN107723362A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莫敏俐;李暉;陳釗;丁鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京雅康博生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測(cè)C-KIT基因突變的引物、探針及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4q11-12，全長(zhǎng)約80kb。C-KIT編碼的C-KIT蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，它是分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)、跨膜區(qū)和配體結(jié)合位點(diǎn)胞外區(qū)。當(dāng)配體與其結(jié)合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通過一系列反應(yīng)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。

胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突變率約為90％。

目前Sanger測(cè)序法是C-KIT基因突變檢測(cè)的主要方法。然而，該方法的靈敏度低，會(huì)導(dǎo)致漏檢及假陰性的發(fā)生，而且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無法滿足臨床檢測(cè)的實(shí)際需求。臨床上迫切需要開發(fā)一種高靈敏度、快速的C-KIT基因突變檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明的發(fā)明人在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)的日常檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了與胃腸道間質(zhì)瘤有關(guān)的位于C-KIT基因的新突變位點(diǎn)，即1675-1681位替換突變。本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)該突變開發(fā)了一種快速、高靈敏、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)試劑盒及相關(guān)的檢測(cè)方法，可以用于GIST化療預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)C-KIT基因突變的引物和探針，所述突變是1675-1681位替換為A(堿基突變：1675_1681＞A，蛋白突變：V559_E561＞A)。本發(fā)明的引物與探針包括如下序列：

正向引物(F)：CCATGTATGAAGTACAGTGGAAGAAG(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：AAGTCACTGTTATGTGTACCCAA(SEQ ID No：2)

探針(PB)：CATGGAAAGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID No：3)

本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測(cè)C-KIT基因1675-1681位突變的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探針。

根據(jù)所采用的PCR方法，本發(fā)明的試劑盒還可以包括內(nèi)參基因和內(nèi)控基因。

本發(fā)明另一方面提供一種檢測(cè)C-KIT基因1675-1681位突變的方法，其包括以下步驟：

(1)提取樣本中的基因組DNA，檢測(cè)樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全血和血漿等；

(2)用本發(fā)明的試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增；

(3)根據(jù)熒光PCR儀顯示的Ct值判斷檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)反應(yīng)體系的FAM熒光強(qiáng)度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰性、陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值＞38或無擴(kuò)增為陰性，Ct值≤38為陽性。

本發(fā)明采用了特異性引物和探針技術(shù)，可以特異性檢測(cè)C-KIT基因突變。此方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快。

附圖說明

圖1為檢測(cè)陰性樣本(野生型)的PCR圖。

圖2為檢測(cè)突變陽性樣本的PCR圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，或者按照制造廠商建議的條件。

一.原理

本發(fā)明的特異性引物與探針同DNA模板結(jié)合后，Taq DNA聚合酶以脫氧核苷酸(dNTP)為底物，對(duì)內(nèi)參基因(Internal Reference，IR)及C-KIT基因突變型基因進(jìn)行體外擴(kuò)增。檢測(cè)采用熒光PCR技術(shù)，通過特異性探針?biāo)忉尫艧晒?，監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)行，確定C-KIT基因突變情況。

本發(fā)明的試劑盒單獨(dú)設(shè)置了內(nèi)參基因檢測(cè)體系。內(nèi)參基因是區(qū)別于待檢C-KIT基因的管家基因。通過檢測(cè)內(nèi)參基因的擴(kuò)增情況(FAM通道)，可分析待檢DNA是否能被正常擴(kuò)增，從而排除DNA純度、濃度不佳，或者含有PCR抑制劑等造成PCR檢測(cè)失敗的情況。