[發明專利]一種蟲草類藥材樣品中兩種微量核苷的檢測方法

有效

• 申請號: 201610648359.9
• 申請日: 2016-08-09
• 公開（公告）號: CN106324121B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 錢正明;田野;李周;周妙霞;李文佳;艾中
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司;宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種在線固相萃取?HPLC法測定蟲草類樣品中兩種微量核苷3’?脫氧腺苷(蟲草素)和其同分異構體2’?脫氧腺苷(異蟲草素)的方法：采用固相萃取?HPLC法進行檢測，固相萃取柱為ZORBAXSB?AQ(12.5mm×4.6mm，5μm)，分析柱為ZORBAX SB?AQ(150mm×4.6mm，5μm)。色譜條件為去離子水?甲醇(91:9)沖洗固相萃取柱3min，除去雜質；六通閥切換使固相萃取柱與分析柱連通，3?5min時流動相逐漸轉化為0.1％甲酸水溶液?甲醇(91:9)，繼續洗脫12min。進樣體積為40μL，流速為1mL/min，柱溫40℃，檢測波長為260nm。本發明方法檢測時間極大縮短，操作簡單，專屬性強，適用于蟲草類樣品中蟲草素和異蟲草素的同時快速分析，采用六通閥切換流路，避免雜質進入分析柱，保護分析柱。

技術領域

本發明涉及藥材中特定成分含量的分析檢測方法，具體涉及一種在線固相萃取-HPLC法快速分析蟲草類樣品中兩種微量核苷類成分3’-脫氧腺苷和2’-脫氧腺苷的方法。

技術背景

蟲草是寄生于昆蟲、少數真菌和植物體上的一類真菌，是廣義蟲草屬真菌的總稱，是具有營養、保健和醫療功效的寶貴生物資源，目前我國的蟲草產業涉及了冬蟲夏草、蛹蟲草、蟬花及其相關真菌的發酵菌絲體等，已經形成了一個巨大的產業，實現了較高的經濟價值和社會效益。蟲草素是最早從蛹蟲草(Cordyceps militaris)中分離得到的一種物質，化學名稱為3′-脫氧腺苷，也是第一個從真菌中分離出來的抗菌性物質，之后許多學者對其進行了驗證研究。現代藥理學研究表明蟲草素還具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節、清除自由基等多種藥理作用。冬蟲夏草中蟲草素的存在與否一直存在爭議。2′-脫氧腺苷也是廣泛存在于蟲草類物種中的一種成分，是蟲草素的同分異構體，其俗名為異蟲草素，其與蟲草素僅一個羥基位置有所差異，兩者結構如下式所示。由于兩者結構非常相似，分子量相同，分離較難，紫外光譜相似，容易造成錯誤判斷。目前主要通過高效液相-質譜聯用的方法對兩種成分進行分離和定量分析，操作復雜，對儀器要求較高。

固相萃取技術(Solid Phase Extraction,SPE)是色譜分析樣品重要的前處理方法，可將痕量被測組分進行濃縮富集，使樣品凈化后將被測組分從樣品基體中轉移到溶劑或氣體中進行分析檢測。目前SPE技術已廣泛應用于中藥材中的微量物質分析。但是離線SPE在提取、洗脫后仍需溶劑揮干和重溶等步驟，耗時耗力，易造成待測物質的損失。

經本申請發明人的研究還發現，很多技術文獻使用HPLC方法所測定的蟲草素并非真正的3′-脫氧腺苷峰，而是2′-脫氧腺苷或者是與其同分異構體3′-脫氧腺苷混合物的峰。而且由于蟲草類樣品中3′-脫氧腺苷和2′-脫氧腺苷含量低，使用普通的紫外檢測器很難檢測，一般需使用高效液相色譜聯合價格昂 貴的質譜儀才能進行檢測，不易準確反映樣品中蟲草素和異蟲草素的真實含量。

發明內容

本發明以3′-脫氧腺苷和2′-脫氧腺苷為對照品，通過在線固相萃取-HPLC分析方法，能夠測定蟲草類樣品中兩者的準確含量。本發明將為蟲草素新的生產和開發工藝提供一種簡單快速、價格低廉的分析方法。

本發明的目的在于提供一種快速、簡便、穩定而又準確的測定蟲草類樣品中3′-脫氧腺苷和2′-脫氧腺苷的在線固相萃取-HPLC方法。本發明通過使用兩種對照品和優化色譜條件，成功地將原來被認為是3′-脫氧腺苷峰的單峰分離為3′-脫氧腺苷峰和2′-脫氧腺苷峰，將能更加準確地反映蟲草類樣品中3′-脫氧腺苷和2′-脫氧腺苷的含量。

本發明提供了一種在線固相萃取-HPLC法分析蟲草類樣品中3’-脫氧腺苷和2’-脫氧腺苷的分析方法，包括以下測定步驟：

a、供試品溶液的制備：準確稱取樣品粉末適量，置于離心管中，加入適量超純水，混勻，超聲提取，搖勻，離心，取上清液過膜，即得供試品溶液；