[發(fā)明專利]一種cfDNA中超低頻突變的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610599150.8
• 申請日: 2016-07-27
• 公開（公告）號: CN107663536B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發(fā)明（設計）人: 鄭文莉;孔祥生;蔣廷亞;黎小鋒
• 申請（專利權）人: 上海奧根診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權代理有限公司 11250
• 代理人: 張建綱

一種cfDNA中超低頻突變的檢測方法，其步驟包括文庫構建、橋式PCR和測序，文庫構建包括末端補平、加A、加接頭、PCR擴增，在加接頭時，使用1:1的頸環(huán)接頭和Y字型接頭。本發(fā)明頸環(huán)接頭和Y字型接頭結合使用，由于Y字型接頭上標記有隨機序列index，基因組坐標始末位點相同的DNA片段加上完全相同的Y字型接頭的概率極低，那么對于始末位點相同的測序reads，就很容易判斷它們來自同一還是多個原始細胞釋放出來的cfDNA，從而降低測序duplication。同時頸環(huán)接頭將DNA片段的正負鏈連成一條鏈，二者的測序reads自然配對，提高了對假陽性的分辨率，從而保證了對cfDNA中超低頻突變的檢測能力。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種cfDNA中超低頻突變的檢測方法。

背景技術

cfDNA，即cell free DNA，是指游離于細胞外的DNA，存在于循環(huán)血漿、尿液和其它體液中，這些DNA是身體細胞和白血球凋亡或壞死時釋放出來的，基本都是無害的，而且在人體中的循環(huán)半衰期很短。cfDNA在醫(yī)學領域和生物領域的作用很大，它主要是雙鏈DNA片段，而且絕大多數(shù)是短鏈，在健康人體內(nèi)通常濃度很低。因為cfDNA的循環(huán)半衰期很短，這提示它需要在細胞凋亡或壞死時被持續(xù)地釋放。在特定的生理條件或疾病過程中，有相當一部分cfDNA會與在健康時的不同，基于這一結果，近年來cfDNA已被用于無創(chuàng)性胎兒染色體異常診斷。在孕婦中，約有10％-15％的cfDNA來自于胎盤滋養(yǎng)層，將cfDNA用于在高危孕婦中篩查胎兒的遺傳缺陷，是當前無創(chuàng)唐氏篩查的基礎！在腫瘤病人中，通過檢測cfDNA中來源于凋亡腫瘤細胞的體細胞突變來確定腫瘤的分子分型、負荷和病灶部位等信息已被越來越多的人認可。而在器官移植方面，排斥反應也與供體移植器官中的cfDNA釋放水平相關。

cfDNA突變檢測具有特異、實時、無創(chuàng)等突出特點，無疑是腫瘤早期篩查、輔助診斷、預后判斷及跟蹤復發(fā)的有效靶標。因此，研究cfDNA突變的檢測方法具有很重要的科學意義。

目前的cfDNA文庫構建方法，主要步驟包括：末端補平、加A、加接頭、PCR擴增。在加接頭這一步，DNA片段兩端加上相同的Y字型接頭，其步驟為：首先提取cfDNA片段，末端補平、加A后為

其中“NNNNNN……NNNNNN”表示互補配對部分。然后合成兩條單鏈DNA片段oligo Ⅰ和oligo Ⅱ，其中oligo Ⅰ為：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’，oligo Ⅱ為：

5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’，其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修飾的；“C*T”中的“*”表示硫代修飾，即“C”與“T”之間的磷酸二酯鍵中的氧原子被硫原子取代，“AACGTGAT”是固定序列index(還可以是其他固定序列index)。將oligo Ⅰ和oligo Ⅱ退火即可形成Y字型結構：

oligo Ⅰ的3’端12個堿基和oligo Ⅱ的5’端12個堿基互補配對，oligo Ⅰ的3’端的T突出，以下兩條引物可以結合在該接頭上進行PCR擴增。

P Ⅰ primer：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，

P Ⅱ Primer：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。