[發(fā)明專利]一種cfDNA中超低頻突變的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610599150.8
• 申請日: 2016-07-27
• 公開（公告）號: CN107663536B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭文莉;孔祥生;蔣廷亞;黎小鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 上海奧根診斷技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11250
• 代理人: 張建綱

1.一種cfDNA中超低頻突變的檢測方法，基于NGS技術(shù)，其步驟包括文庫構(gòu)建、橋式PCR擴(kuò)增和測序，其特征是：所述文庫構(gòu)建過程包括末端補(bǔ)平、加A、加接頭、PCR擴(kuò)增步驟，在加接頭步驟中，使用1:1的頸環(huán)接頭和Y字型接頭，所述頸環(huán)接頭的結(jié)構(gòu)為：其中表示成環(huán)序列中的若干個堿基；上下“YYYYY……YYYYY”表示互補(bǔ)配對的序列，其中“Yp”中的“p”表示“Y”是磷酸化修飾的；“Y*T”中的“*”表示硫代修飾，即“Y”與“T”之間的磷酸二酯鍵中的氧原子被硫原子取代；“biotin”表示生物素標(biāo)記；在頸環(huán)接頭的“3’端”和“5’端”互補(bǔ)配對后，所述堿基“X”為“A”，并且必須堿基之間不能相互配對才能形成頸環(huán)。

2.如權(quán)利要求1所述的cfDNA中超低頻突變的檢測方法，其特征是：所述頸環(huán)接頭中“YYYYY……YYYYY”表示的堿基個數(shù)為12個以上；所述成環(huán)序列的堿基個數(shù)為五個以上。

3.如權(quán)利要求2所述的cfDNA中超低頻突變的檢測方法，其特征是：所述頸環(huán)接頭中3’端的“YYYYY……YYYYY”為“ACTGGCAGGAAC”，5’端的“YYYYY……YYYYY”為“GTTCCTGCCAGT”。

4.如權(quán)利要求3所述的cfDNA中超低頻突變的檢測方法，其特征是：所述頸環(huán)接頭由合成單鏈DNA片段oligo1退火形成，所述單鏈DNA片段oligo1為：

5’-pGTTCCTGCCAGT-AAAAA-ACTGGCAGGAAC*T-3’；頸環(huán)接頭的結(jié)構(gòu)為：

5.如權(quán)利要求1所述的cfDNA中超低頻突變的檢測方法，其特征是：所述Y字型接頭的結(jié)構(gòu)為：

其中“Gp”中的“p”表示“G”是磷酸化修飾的；“C*T”中的“*”表示硫代修飾，即“C”與“T”之間的磷酸二酯鍵中的氧原子被硫原子取代；“NNNNNNNN”為隨機(jī)序列index，“AACGTGAT”為固定序列index。

6.如權(quán)利要求5所述的cfDNA中超低頻突變的檢測方法，其特征是：所述Y字型接頭由兩條合成單鏈DNA片段oligo2和oligo3退火形成，所述單鏈DNA片段oligo2為：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’；

所述單鏈DNA片段oligo3為：

5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修飾的；“C*T”中的“*”表示硫代修飾，即“C”與“T”之間的磷酸二酯鍵中的氧原子被硫原子取代，“NNNNNNNN”為隨機(jī)序列index，“AACGTGAT”為固定序列index。