[發明專利]人工合成的ArenimonasdonghaensisiDSM18418蛋白編碼基因及其應用

在審

• 申請號: 201610577111.8
• 申請日: 2016-07-20
• 公開（公告）號: CN107641628A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 朱惠霖;丁雪峰;陳令偉;婁向弟
• 申請（專利權）人: 南京諾云生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司32206
• 代理人: 張慧清

技術領域

本發明涉及人工合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白編碼基因及其應用，特別是涉及一種根據大腸桿菌偏好密碼子設計并合成的Arenimonas donghaensisi DSM 18418蛋白編碼基因及其應用，屬于基因工程領域。

背景技術

我們發現來源于Arenimonas donghaensis DSM 18148的氨基酸序列為序列表中序列2所示的Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白可以作為一種催化劑用于L-2-哌啶甲酸的合成。將編碼其的基因序列克隆到某一菌體中，從而通過這一重組菌體以全細胞催化劑的形式來實現其催化效果。

但是用于其編碼的如序列表中序列1所示的野生型基因序列無法滿足上述需求。因此，為了更好地實現這一蛋白的催化效果，我們就需要提供一種方式，使其可以在某一菌體中高效表達。

發明內容

首先我們選擇大腸桿菌作為用于高效表達Arenimonas donghaensis DSM 18148蛋白的菌體。并通過全基因合成的方法，對基因的二級結構以及密碼子偏好性進行調整，采用大腸桿菌偏好性密碼子對其進行優化，從而實現大腸桿菌中的高效表達。

具體來說我們利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)進行設計，并保證Tm差異控制在3℃以內，引物長度控制在50base以內。按照設計好的引物合成，得到目標引物后，將獲得的引物加雙蒸水溶解后，加到如下的反應體系中，使得各引物的終濃度為30nM，首尾引物的終濃度為0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)5μl 10×Pfu buffer 5μl Pfu DNA polymerase(10U/μl) 0.5μl ddH2O 使得反應體系總體積至50μl

將配制好的PCR反應體系置于博日XP cycler基因擴增儀中，按下列程序進行擴增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。將PCR得到的DNA片段進行切膠純化，利用同源重組的方法克隆進pET30a的NdeI/XhoI位點。

利用這一方法，我們獲得了如序列表中序列3-序列7所示的5條優化合成的DNA序 列。其中基因表達最優選為NYPDc。

具體的：

當引物如下時，所獲得的DNA序列為SEQ ID NO.3，命名為NYPDa：

1TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCATGACCCAGCTGACCA

2GGGTAGCAACGATCTGGGTCAGGTCCTGGGTGGTCAGCTGGGTCATGG

3ACCCAGATCGTTGCTACCCACGGTCTGCCGACCCTGCTGGGTCGTCTG

4AACGACGGAAGTCAGCTTCCAGGTAGTCAACCAGACGACCCAGCAGGG

5GAAGCTGACTTCCGTCGTTGGGAAGACTTCGACAAATCTCCGCGTTCT

6TCGATAACACCACCCGGAGAGTGAGCAGCAGAACGCGGAGATTTGTCG

7TCCGGGTGGTGTTATCGAACTGATGCCGGTTGCTGACACCAAAGAATA

8GGTGACCGTTAACGTATTTGAAAGAGTATTCTTTGGTGTCAGCAACCG