[發明專利]一種在植物中表達重組人血清白蛋白的方法

在審

• 申請號: 201610576100.8
• 申請日: 2016-07-20
• 公開（公告）號: CN107641155A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 戴光;孫玉合;王堯;陳雅瓊;王倩;陳浣;崔萌萌;孫偉;格根古娃
• 申請（專利權）人: 北京泰柏生物科技有限責任公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/82;C12N15/74;C12N5/10;C12N1/21;A01H5/00;C12P21/02;A01H6/82
• 代理公司: 北京漢德知識產權代理事務所(普通合伙)11328
• 代理人: 劉子文,徐馳

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域，具體來說，涉及在植物中高效表達重組人血清白蛋白的方法。

背景技術

人血清白蛋白是由585個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質，分子量為67kDa，它是人血漿中的主要成分，在肝臟中合成后分泌進入血液。人血清白蛋白是一種醫療上大規模使用的藥用蛋白，每年全世界市場需求約600噸左右，市場價值大約30億美元。白蛋白具有維持血液滲透壓、抗休克、運輸與解毒、促進肝細胞修復與再生等作用，在臨床上主要用于：失血創傷、燒傷引起的休克，腦水腫及損傷引起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹水，低蛋白血癥的防治，新生兒高膽紅素血癥，還用于心肺分流術、燒傷的輔助治療、血液透析的輔助治療和成人呼吸窘迫綜合癥。

目前醫用人血清白蛋白主要通過血液分級過濾得到，不僅價格較高(約5美元/g)，而且產能較低，有限的血液資源極大地限制了白蛋白的生產和使用，供給遠遠不能滿足市場需要。

自1981年首次從人肝臟cDNA文庫中克隆得到人血清白蛋白基因cDNA全序列以來，人們一直在嘗試利用基因工程技術在不同的物種中高效表達重組人血清白蛋白，取得了一定的進步，但是仍然受困于表達量不夠高，高度純化比較困難等難題。

目前重組生物制藥中普遍采用大腸桿菌、酵母等微生物發酵制備，但此方法存在諸多缺點，例如：微生物與人體環境差異大，表達產品生物活性低，摻雜的微生物毒素難以徹底去除，生產工藝復雜，很難形成規模化生產等。

近年來也有利用轉基因技術制備轉基因動物來制備人重組蛋白產品，與傳統的微生物表達系統相比，動物生物反應器具有以下優點：(1)生產的蛋白質生物活性高，能夠對重組蛋白質進行多種翻譯后加工，非常接近天然產品；(2)表達量大、成本低；(3)產品易提純、質量高，避免了化學及生物毒素的污染；(4)易產業化，外源目的基因能夠遺傳，使得某一群體都具有同一特性，可通過動物繁殖擴群，進行規模化生產。但人類基因是隨機插入動物的基因組內，雖然與微生物發酵相比有很大優勢，但也存在很多不可控的因素和缺陷：(1)目的基因的整合與表達效率較低；(2)有可能引起宿主細胞基因突變；(3)轉基因模型與預期結果不符，或表達個體的機能紊亂；(4)動物本身的相應蛋白質在純化中很難去除，容易引起人類的過敏反應。因此，轉基因動物也不是理想的生物反應器。

目前，已經將植物表達系統視為動物細胞培養的有前景替代物用于大規模生產重組蛋白，轉基因植物中蛋白質的生產方法可以參見例如：美國專利第5750871號、第5565347號、第5464763號、第5750871號和第5565347號等。盡管植物的大量生長和采集比原核和真核細胞便宜，但植物細胞中外來基因的表達量通常較低。

發明內容

為了克服現有技術存在的缺陷，本發明人經過長期研究，發明了一種在煙草植株中高效表達重組人血清白蛋白(rHSA)的方法。

本發明的第一方面提供了rHSA的氨基酸序列及其編碼序列。

本申請中rHSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

任何能夠編碼rHSA的核酸均可用于本發明。優選地，rHSA編碼序列具有選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。更優選地，rHSA編碼序列根據宿主細胞的密碼子偏好情況進行了密碼子優化。在一個最優選的實施方案中，rHSA編碼序列如SEQ ID NO:3所示，其在下文稱為yhsa基因。

yhsa基因序列是發明人根據煙草密碼子偏好性在天然人血清白蛋白基因序列(hsa基因)基礎上人工設計得到的，其長度為1830bp，與hsa基因長度相同，且編碼相同的氨基酸序列。

由于植物相比動物，其密碼子偏好性一定的共性，因而本發明的yhsa基因不僅能夠在煙草中高水平表達，在其他植物，例如擬南芥、水稻、小麥、玉米、大豆中也能取得高水平表達。優選地，所述植物為茄科植物。

本發明的第二方面提供了包括本發明的核酸的核酸構建體、載體和宿主細胞。

優選地，所述載體衍生自pCHF3載體。

在一個特定的實施方案中，所述載體為pCHF3-yhsa，其是將yhsa基因插入pCHF3載體的KpnI和SalI酶切位點之間構建得到的。

本發明的宿主細胞選自細菌、真菌、動物和植物細胞。優選地，所述細菌細胞選自大腸桿菌和農桿菌，所述植物細胞選自茄科植物細胞。最優選地，所述植物細胞為煙草細胞。