[發明專利]一種熒光標記的全氟烷基酸探針及其應用

有效

• 申請號: 201610543421.8
• 申請日: 2016-07-11
• 公開（公告）號: CN106187981B
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 任肖敏;曹林英;楊郁;郭良宏
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C07D311/82
• 分類號: C07D311/82;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,王春霞

技術領域

本發明涉及一種熒光標記的全氟烷基酸探針及其應用，屬于生物分析領域。

背景技術

全氟烷基酸(Perfluoroalkyl acids,PFAAs)是一類由完全氟化的烷基鏈和末端的極 性酸性官能團組成的化合物。由于PFAAs的C-F共價鍵具有極高化學鍵能，因此這類 化合物普遍具有非常高的穩定性，能夠經受強的熱處理、光照、化學處理、生物代謝 作用而不降解。PFAAs特別的化學結構使其具有非常特殊的化學性質：既具有疏水性 也具有疏油性。因此，PFAAs被廣泛的應用在多個工業和消費產品領域：如紡織、造 紙、不粘涂料和滅火泡沫等。目前PFAAs包含約20種化合物，具有不同碳鏈長度(長 度為4碳至18碳)和不同極性官能團(如磺酸鹽、羧酸鹽等)。由于PFAAs化合物的大 量使用，以及其高穩定性和易于在環境中、生物體內富集的特點，PFAAs已經成為一 種全球性的新型持久性有機污染物。

動物實驗表明PFAAs具有多種毒性作用，包括肝毒性、內分泌干擾作用、胚胎毒 性、生殖毒性、神經毒性和潛在的致癌性等。但是其毒理機制目前還不清楚，原因之 一是PFAAs在生物體內作用的靶蛋白還不明確。篩選PFAAs潛在的生物靶蛋白對于 深入研究其毒理機制具有重要意義。在前期，已經有研究人員建立了一些用于探索 PFAAs在生物體內可能的靶蛋白的方法。Wolf等(Wolf et al.,Toxicological Sciences,2008,1:162-171)通過熒光素酶表達體系證明PFAAs能夠與過氧化物酶體增殖 受體(PPARs)作用。Kjeldsen等(Kjeldsen et al.,Environ Sci Pollut Res.,2013,20:8031-8044) 也通過熒光素酶表達體系證明PFAAs能夠作用于雌激素受體(ER)。以上熒光素酶表 達體系的方法需要在細胞中轉染相應的核受體調控的熒光素酶報告質粒，操作復雜， 對操作人員技術要求高。而且該方法僅限于研究PFAAs與核受體類蛋白的相互作用， 不能用于研究酶、轉運蛋白等其他類型的蛋白。Chen等(Chen et al.,Arch Toxicol., 2009,83:255-261)通過測定人血清白蛋白(HSA)內源性熒光信號的變化，證實PFAAs 能夠與HSA結合。該方法操作簡便，但是只能局限于研究具有內源性熒光信號的蛋白。 而且對于一些蛋白，PFAAs與其結合并不會導致其內源熒光信號變化，容易造成假陰 性結果。Benninghoff等(Benninghoff et al.,Toxicological Sciences,2011,1:42-58)通過放 射性標記的雌激素探針競爭法，研究PFAAs與ER的相互作用。Ren等(Ren et al.,Arch Toxicol.,2015,89:233-242)通過熒光素標記的甲狀腺激素探針競爭法，研究PFAAs與 甲狀腺激素受體(TR)的結合作用。以上放射性探針和熒光探針的方法需要針對目標 蛋白設計合成特異性的探針，方法具有很大的局限性。對于一些不能得到特異性探針 的蛋白，就無法采用探針競爭法研究PFAAs與其相互作用。除此之外，上述各種實驗 方法只能針對性的研究PFAAs與某一種蛋白的相互作用，缺乏系統性。

發明內容

本發明的目的是提供一種熒光標記的全氟烷基酸探針及其應用，本發明熒光標記 的全氟烷基酸探針與檢測待測樣品的結合檢測方法簡單有效，能建立定性定量的研究 蛋白與探針結合能力的方法，本發明熒光標記的全氟烷基酸探針能有效的用于篩選 PFAAs潛在的生物靶蛋白。

本發明提供的全氟烷基酸探針為式Ⅰ所示的化合物：

R₁-L-(CF₂)_n-R₂

式Ⅰ

式Ⅰ中，R₁為產生熒光檢測信號的無機基團或有機基團；n為4～20之間的整數； L為連接R₁和(CF₂)_n的化學結構；R₂為羧基或磺酸基。

上述的全氟烷基酸探針中，R₁可為5(6)-羧基熒光素基團、CY3基團或CY5基團， 其結構式分別如下式Ⅲ、式Ⅳ和式Ⅴ所示；

L為-NH-(CH₂)_m-NH-，其中m為4～6之間的整數。