[發(fā)明專利]一種豬肺炎支原體的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610436792.6
• 申請(qǐng)日: 2016-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN107513507A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田克恭;翟路峰;孫進(jìn)忠;張?jiān)S科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/35
• 代理公司: 北京華夏正合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11017
• 代理人: 韓登營

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬肺炎支原體的制備方法，以及其制備的疫苗組合物和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體引發(fā)的一種慢性肺炎，長期以來，本病一直被認(rèn)為是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失、且最常發(fā)生、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一。當(dāng)豬肺炎支原體伴有其他病原混合感染或繼發(fā)感染時(shí)，表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)熱、死亡等；反之，未伴有其他病原體時(shí)，病情顯得較為簡單，呈現(xiàn)亞臨床癥狀，表現(xiàn)為慢性無痰干咳、平均日增重下降和飼料轉(zhuǎn)化率降低。近幾年來，通過使用藥物和疫苗以及合理的管理方法大大的減輕了豬地方性肺炎對(duì)豬群肺組織的損害，但本病仍然廣泛流行于世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)仍然造成了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國外許多養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家已對(duì)豬肺炎支原體的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，表明30％-100％的育肥豬都表現(xiàn)為豬肺炎支原體血清抗體陽性，屠宰場(chǎng)的流行病學(xué)資料顯示38％-100％豬群都感染了豬肺炎支原體。

采用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防是國內(nèi)外控制豬肺炎支原體感染的根本手段。豬肺炎支原體的培養(yǎng)困難較大，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式耗時(shí)長、抗原滴度低，是目前豬肺炎支原體疫苗規(guī)模化生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中豬肺炎支原體疫苗生產(chǎn)的難題，本發(fā)明對(duì)豬肺炎支原體的培養(yǎng)方式和疫苗制備方法進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)了在不增加成本的情況下，大大提高了疫苗的免疫效果，能夠有效地預(yù)防豬肺炎支原體的感染。

本發(fā)明涉及一種豬肺炎支原體的制備方法，其制備的豬肺炎支原體的抗原，具有大大提高疫苗的免疫效力的效果，所述豬肺炎支原體的制備方法包括：步驟(1)使用液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)豬肺炎支原體或其培養(yǎng)物進(jìn)入穩(wěn)定期；步驟(2)調(diào)節(jié)所述液體培養(yǎng)基pH值為7.2-7.6；以及步驟(3)繼續(xù)培養(yǎng)所述豬肺炎支原體至液體培養(yǎng)基pH值下降為6.8-7.0。

本發(fā)明還涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的所述制備方法制備的豬肺炎支原體的抗原和藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還涉及所述疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬支原體肺炎和豬肺炎支原體感染相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)活菌含量繪制的豬肺炎支原體的生長曲線。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。

“穩(wěn)定期”意指微生物在恒定體積的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以細(xì)胞對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)的生長曲線上，生長速率常數(shù)等于0的時(shí)期，體系處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長與負(fù)生長相等的動(dòng)態(tài)平衡中。

“培養(yǎng)物”是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次之間其基因序列僅可能會(huì)發(fā)生微小的變異。

本發(fā)明涉及一種豬肺炎支原體的制備方法，其中，所述豬肺炎支原體的制備方法包括：步驟(1)使用液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)豬肺炎支原體或其培養(yǎng)物進(jìn)入穩(wěn)定期；步驟(2)調(diào)節(jié)所述處于穩(wěn)定期的液體培養(yǎng)基pH值為7.2-7.6；以及步驟(3)繼續(xù)培養(yǎng)所述豬肺炎支原體至液體培養(yǎng)基pH值下降為6.8-7.0。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述液體培養(yǎng)基的配方為(按1065mL計(jì))：牛心浸液(BD公司)300mL，ddH2O 360mL，調(diào)pH值到7.4，121℃高壓滅菌15min。再加入下列過濾除菌的成分：Hank’s平衡鹽溶液(10×)40mL，0.25％(W/V)酚紅10mL，滅活馬血清200mL，5％(W/V)水解乳蛋白100mL，25％(W/V)酵母浸出液20mL，10000IU/mL青霉素10mL，1％醋酸鉈溶液25mL。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的豬肺炎支原體的制備方法中，所述步驟(1)中所述擴(kuò)增培養(yǎng)豬肺炎支原體進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)所述液體培養(yǎng)基pH值下降為6.8-7.0。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的豬肺炎支原體的制備方法中，所述步驟(2)中調(diào)節(jié)所述處于穩(wěn)定期的液體培養(yǎng)基pH值為7.4。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的豬肺炎支原體的制備方法中，所述步驟(3)中繼續(xù)培養(yǎng)所述豬肺炎支原體0.5天以上。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的豬肺炎支原體的制備方法中，所述步驟(3)中繼續(xù)培養(yǎng)所述豬肺炎支原體0.5天-2天。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的豬肺炎支原體的制備方法中，所述步驟(1)中使用液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)所述豬肺炎支原體或其培養(yǎng)物為多級(jí)培養(yǎng)。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的豬肺炎支原體的制備方法中，所述步驟(1)中使用液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)所述豬肺炎支原體或其培養(yǎng)物為三級(jí)培養(yǎng)。