[發明專利]唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯免疫檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201610416892.2
• 申請日: 2016-06-14
• 公開（公告）號: CN106153893B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 刁宏燕;盧翀;陳佳寧;侯顯良;王琳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 周世駿

技術領域

本發明涉及生物技術和醫學檢測領域，具體為唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯免疫檢測試劑盒，旨在建立一種快速、無創檢測人體內AMA-M2水平的技術。

背景技術

酶聯免疫吸附實驗法(ELISA)是分析化學領域中較為成熟的技術之一，是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種免疫測定技術。該技術采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。測量時，抗原(抗體)先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體(抗原)與酶結合成的偶聯物(標記物)，此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯物與固相載體上的抗原(抗體)反應結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產物可用酶標儀加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強，敏感度高，易于推廣。

PBC是一種自身免疫性肝病，主要表現為肝內小膽管的進行性破壞，最終導致肝硬化，甚至肝衰竭，嚴重危害人類健康。因PBC發病隱匿，疾病的早期篩查、早期發現和早期處理，對PBC的治療和病人的預后十分重要。抗線粒體抗體(AMA)，特別是抗線粒體抗體M2型(AMA-M2)，是PBC的特異性血清學標志，其特異度和靈敏度都高達95％以上，是目前臨床用于診斷PBC的重要指標。現有的血液檢測技術雖十分成熟，但其自身有一定的局限性：1、首先血液的獲取是一種有創的手段，樣本的獲取需要有專業的技術；2、血液獲取過程中，受試者易產生不適感和一定感染風險；3、血液樣本的獲取和處理成本較高。正因為這些缺陷的存在，血液檢測并不利于原發性膽汁性肝硬化的大規模篩查，尋找一種無創便捷的介質進行AMA-M2檢測是十分必要的。

唾液是一種無色且稀薄的液體，唾液中含有電解質，蛋白質，酶，細胞因子等成分。唾液主要由唾液腺分泌，而外周血中的成分可以通過被動擴散，主動運輸，超濾等方式進入唾液。因此，唾液可以在一定程度上反映外周血的情況，而且唾液的獲取具有無創，易獲得，技術要求低，成本低等諸多優勢，是一種理想的血清替代品。目前，用于檢測AMA-M2局限于血液途徑，利用唾液進行AMA-M2檢測的試劑盒和方法還沒出現。本發明主要是利用改良的AMA-M2檢測試劑盒進行唾液中AMA-M2檢測的方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯免疫檢測試劑盒。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯免疫檢測試劑盒，該試劑盒中包括下述組分：

AMA-M2標準品；

M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶標二抗：辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人IgG；

樣本稀釋液：質量濃度0.1％的BSA-PBS溶液；

輔助試劑：底物顯色液、反應終止液和清洗緩沖液。

本發明中，所述樣本稀釋液的配制方法為：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖溶液1L，充分溶解。

本發明中，所述底物顯色液為TMB/H₂O₂，是通過下述方法配制獲得：

(1)配制底物顯色液A：

取四甲基聯苯胺(TMB)20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、檸檬酸95mg、甘油5ml，以ddH₂O定容至50ml后混勻，避光保存；

(2)配制底物顯色液B：

取醋酸鈉1.36g、檸檬酸0.16g、30％過氧化氫(H₂O₂)30ul，以ddH₂O定容至50ml后混勻；

(3)使用前，將底物顯色液A、B液等體積混勻，即得底物顯色液TMB/H₂O₂。

本發明中，所述反應終止液為：0.5M硫酸。

本發明中，所述清洗緩沖液是質量濃度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法為：取吐溫20500ul，加入pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖溶液1L，充分溶解。

本發明進一步提供了所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)將獲取的唾液樣本離心后吸取上清，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的體積比稀釋；