[發明專利]基于微流控芯片的單細胞液滴高通量篩選方法

在審

• 申請號: 201610415873.8
• 申請日: 2016-06-14
• 公開（公告）號: CN107502648A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 王立言;畢鮮榮
• 申請（專利權）人: 無錫源清天木生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種細胞篩選方法，尤其涉及一種基于微流控芯片的單細胞液滴高通量篩選方法。

背景技術

近年來，微流控芯片(Microfluidic Chip,MC)技術蓬勃發展，并逐步進入產業化時代。微流控技術具有快速、高效、低耗等優點，在生物學、高通量藥物篩選、疾病診斷等眾多應用領域具有廣闊的前景。其中，基于微流控技術的微液滴熒光篩選技術(Fluorescence-Activated DropletSorting,FADS)受到高通量篩選領域研究人員的高度關注。其核心是將待檢樣品和熒光標記物共同包裹在液滴內(油包水)，從而實現待檢樣品的流動檢測和分選。在我國，中科院天津工業生物技術研究所的研究人員將該技術應用到微生物培養胞外產物的包裹，從而實現代謝物的高通量篩選，其篩選效率可以達到10～100個液滴每秒。然而，這些工作在解決工業微生物高通量篩選方面仍然面臨如下技術缺陷：(1)缺乏單細胞培養技術，微生物的培養過程是在深孔板體系執行的，其通量成為整體篩選效率的瓶頸；(2)熒光標記體系采用傳統的雙酶偶聯法，成本高、體系兼容性差，應用范圍有限。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于微流控芯片的單細胞液滴高通量篩選方法。

本發明的技術方案如下：

一種基于微流控芯片的單細胞液滴高通量篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)在微流控芯片上生成微生物單細胞液滴；

(2)棄置未包裹微生物液滴；

(3)將培養后的微生物單細胞液滴與小分子化合物生物傳感器液滴在微流控芯片上融合；

(4)生物傳感器響應融合液滴中的代謝產物，進行熒光檢測和分選。

其中，步驟(1)中所述微生物單細胞液滴通過極端稀釋、油相包裹水相的方式實現。這種方法將不需要更低尺度的微流控芯片，極大的降低了芯片的加工成本。

其中，步驟(2)中所述微生物單細胞液滴經培養后產生胞外產物。

優選地，所述胞外產物為小分子化合物。

進一步優選地，所述小分子化合物包括有機酸。

上述步驟還包括所述融合液滴的分離。培養后的微液滴和小分子生物傳感器液滴，在芯片中進行融合，形成新的檢測液滴；共培養后，新的檢測液滴將通過熒光檢測并進行評價，并進行分離；分離后的混合菌經過稀釋涂布平板或者抗性篩選等手段可獲得純目標生產菌株。

有益效果：本發明所提供的方法，通過在微流控芯片上進行單細胞液滴培養，相當于在芯片上構建上千個微型生物反應器，可以實現對待篩微生物細胞生長特性的追蹤和篩選；通過液滴融合技術，實現小分子代謝產物生物傳感器對含待篩微生物細胞液滴的熒光標記，進而實現對目標胞外產物的篩選。這一獨特的設計原理，保證了在篩選目的產物表型的同時不丟失生長優勢表型，大大提高篩選效率；液滴融合技術不需要將生物傳感器導入待篩細胞中(這是FACS技術必須步驟)，避免了基因操作，特別適合于大量沒有基因操作工具的工業菌株的高效選育。

附圖說明

圖1為本發明實施例的基于微流控芯片的單細胞液滴高通量篩選方法的原理圖。

具體實施方式

下面結合實施例，進一步闡述本發明。

圖1給出了基于微流控芯片的單細胞液滴高通量篩選方法的原理圖。

第1步，在微流控芯片上生成微生物單細胞液滴。通過極端稀釋、油相包裹水相的方式實現在微流控芯片每一個微液滴里包埋單個細胞，進而在微流控芯片溶氧控制裝置里進行培養，實現微生物的擴增、目的待測產物的生成。

第2步，棄置未包裹微生物液滴。

第3步，經培養后微生物產生胞外產物，比如有機酸等小分子化合物。

第4步，融合小分子化合物生物傳感器液滴，即將培養后的微生物單細胞液滴與小分子化合物生物傳感器液滴在微流控芯片上融合。采用有別于FACS胞內熒光標記的技術路線，通過液滴融合技術將小分子生物傳感器整合到檢測系統中，避免了基因操作，特別適合于大量沒有基因操作工具的工業菌株的篩選。

第5步，生物傳感器響應小分子代謝產物形成熒光，用于測定和分選。比如，通過研制特異性小分子生物傳感器，將微液滴中小分子的濃度與熒光強度偶聯起來，實現對該小分子產量的實時高通量篩選。將該調控蛋白系統置于大腸桿菌中，做成特定有機酸分子的生物傳感器，放入每個微液滴中，則可通過熒光強度對各個微液滴中菌群產生有機酸的產量進行表征并實現高通量篩選。該方法不會對待測菌株的生長狀態產生干擾，特異性強，靈敏度高，同時又適于菌群的整體檢測。

此外，經混合液滴熒光檢測、分選后所得混合菌群，可以通過簡單的稀釋涂布或者抗性篩選等方法，較為容易的獲得目標生產菌株的單菌落。