[發(fā)明專利]基于分子印記納米磁珠與質(zhì)譜聯(lián)用用于大鼠糞便中三七總皂苷代謝物質(zhì)群的檢測方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610403918.X
• 申請(qǐng)日: 2016-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN107478759A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周學(xué)敏;洪俊麗;蔡奇志;楊載月;陳寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/08
• 代理公司: 北京思創(chuàng)畢升專利事務(wù)所11218
• 代理人: 高爽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種三七總皂苷代謝物質(zhì)群的分析方法，具體涉及一種基于分子印記納米磁珠分散固相萃取與Orbitrap-MS技術(shù)聯(lián)用用于大鼠糞便中三七總皂苷代謝物質(zhì)群的檢測方法。

背景技術(shù)

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥發(fā)揮預(yù)防、治療、診斷疾病作用的化學(xué)成分的集合。由于中藥成分多樣性、作用整體性、作用靶點(diǎn)復(fù)雜性，闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)已成為中藥研究的關(guān)鍵和核心問題，已列入國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020)、“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)以及中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020)相關(guān)領(lǐng)域和主題的重要內(nèi)容。因此建立基于整體觀、符合中醫(yī)藥特點(diǎn)和具有廣泛適用性的中藥復(fù)雜藥效物質(zhì)研究關(guān)鍵技術(shù)具有重要意義。

三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根莖。為我國名貴中藥材，國際著名的“云南白藥”和“片仔癀”中主要原料均為三七，其具有止血、造血、抗血栓、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)活性、等藥理作用^[15-20]。三七中富含以人參皂苷R_g1和三七皂苷R₁為代表的原人參三醇(protopanaxatriol,PPT group)類和以人參皂苷Rb1為代表的原人參二醇(protopanaxadiol,PPD group)類成分。中國藥典2010版采用高效液相色譜法對(duì)上述三種指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制。但皂苷類成分復(fù)雜，紫外吸收響應(yīng)極低，一直是三七質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥效物質(zhì)研究的難點(diǎn)。針對(duì)其分析難點(diǎn)，目前已有研究采用HPLC–ELSD、MEKC、HSCCC、LC–MSⁿ、UPLC–ESI-MS以及UPLC–Q/TOF技術(shù)對(duì)其皂苷類成分進(jìn)行鑒定。體內(nèi)代謝研究表明，PPT和PPD結(jié)構(gòu)類型的皂苷類成分主要以氧化反應(yīng)和去糖基化的水解反應(yīng)為主，其代謝產(chǎn)物的藥理活性在不斷深入研究和報(bào)道。但上述兩種結(jié)構(gòu)類型的皂苷類成分體內(nèi)生物利用度低，體內(nèi)代謝產(chǎn)物難以檢測。目前僅能對(duì)原型及主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，一些微量的代謝產(chǎn)物往往檢測不到或者丟失，需要一種選擇性強(qiáng)專屬性好的富集分離模式并建立基于整體觀的體內(nèi)外物質(zhì)組表征方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種基于分子印記納米磁珠與LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)聯(lián)用用于大鼠糞便中三七總皂苷代謝物質(zhì)群的分析方法。本發(fā)明通過制備出具有高磁響應(yīng)性的磁性納米粒，為MIPs的制備省去離心、過濾等繁雜的操作，使其更加省時(shí)、方便。針對(duì)中藥三七代謝產(chǎn)物的主要活性成分，發(fā)明人通過表面分子印記技術(shù)和磁性分離技術(shù)的交叉研究，制備出對(duì)三七皂苷類化合物具有高靈敏度、高選擇性印記磁珠，針對(duì)中藥體內(nèi)代謝物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用相應(yīng)的印記磁珠“垂釣”體內(nèi)代謝物質(zhì)群，實(shí)現(xiàn)中藥三七總皂苷提取物給藥后的“多靶標(biāo)富集”，對(duì)目標(biāo)群進(jìn)行LTQ-Orbitrap-MS的鑒定與分析，這與傳統(tǒng)的有效部位給藥后分析代謝物質(zhì)的方法相比，更充分考慮中藥整體(包括復(fù)雜的基質(zhì)背景)作用的特點(diǎn)，有望揭示三七“原型成分-代謝物質(zhì)群-活性”的相關(guān)性，為中藥代謝物質(zhì)群的研究建立了一個(gè)有效的分析平臺(tái)。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：

一種基于分子印記納米磁珠與LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)聯(lián)用用于大鼠糞便中三七總皂苷代謝物質(zhì)群的分析方法，該方法包括以下步驟：

(1)制備印記磁珠：將Fe₃O₄@SiO₂納米粒分散于致孔劑中，加入功能單體，交聯(lián)劑，引發(fā)劑，模板分子人參皂苷Rb₁，攪拌，室溫聚合20h，再用乙酸和甲醇混合溶液洗去模板分子，真空干燥；乙酸和甲醇混合溶液的體積比為10：90。

(2)樣品處理：大鼠給藥三七總皂苷水溶液后，分別于4,8,12,16,20,24,36,72小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)取糞便樣品，將每份樣品取出相同的量制成混合糞便，隨后混合糞便樣品處理如下：將混合糞便加入樣品重3倍的預(yù)處理溶劑渦旋、離心后，取上清液，氮?dú)獯蹈桑A(yù)處理溶劑復(fù)溶，加入印記磁珠進(jìn)行吸附解析得到解析液；大鼠給藥三七總皂苷水溶液的劑量為600mg/kg；

(3)樣品分析：利用LTQ-Orbitrap-MS分析儀對(duì)解析液進(jìn)行分析，鑒定三七總皂苷的代謝物質(zhì)群: