[發明專利]一種定量檢測超敏C反應蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的熒光免疫層析方法

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• 申請號: 201610401854.X
• 申請日: 2016-06-09
• 公開（公告）號: CN107490692A
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發明（設計）人: 李亞星;劉鳳鳴;劉冰
• 申請（專利權）人: 常州博聞迪醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/92;G01N33/558;G01N33/533
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技術領域

本發明屬于免疫檢測分析技術領域，尤其涉及一種定量檢測超敏C反應蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的熒光免疫方法。

背景技術

心腦血管疾病是嚴重威脅人類，特別是中老年人健康的常見病，全世界每年死于心腦血管病的人數高達千萬人，居各種死因首位。經研究證實，心腦血管疾病發生發展很大程度上與動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)相關。定性定量的評估AS的嚴重性，有助于有效的預測和判斷心腦血管栓塞狀態，預防心腦血管事件的發生。AS是一種炎性疾病，炎癥反應參與了其發生的各個環節，在AS的起始、發展以及穩定性喪失和斑塊破裂脫落中均起著重要作用。Lp-PLA2是目前國際上公認的一種新的炎性反應標志物，血液中的Lp-PLA2主要由單核-巨噬細胞和淋巴細胞等炎癥細胞合成和分泌。血液中Lp-PLA2含量是預測心血管病、冠心病、腦卒中等疾病的風險預測因子。Lp-PLA2又稱血小板活化因子乙酰水解酶，是一類催化脂蛋白和細胞膜上的甘油磷脂二位酰基酯鍵水解形成非酯化脂肪酸和溶血磷脂的酶族，屬于擴大的磷脂酶A2超家族，但是與其他磷脂酶A2超家族成員不同，其生物活性不依賴于鈣離子。Lp-PLA2編碼基因(PLA2G7)于1995年首次被克隆，具有12個外顯子，定位于6號染色體p21.2～12，由441個氨基酸殘基組成的一種絲氨酸酯酶，分子量為45 KDa。Lp-PLA2分兩類，即在循環中分泌型的Lp-PLA2和存在于動脈粥樣斑塊中的Lp-PLA2。循環分泌型的Lp-PLA2約70%～80%與低密度脂蛋白LDL結合，20%～30%與高密度脂蛋白或其他脂蛋白結合。Lp-PLA2與LDL結合，生成溶血卵磷脂(Lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游離脂肪酸(Oxidized Free Fatty Acids，Ox-FA)，兩者為促炎性物質，通過刺激產生黏附因子和細胞因子，而促進單核細胞由血管腔向血管內膜聚集。然后，單核細胞在內膜下聚集后衍生為巨噬細胞。最后巨噬細胞吞噬氧化型低密度脂蛋白變成泡沫細胞，最終聚集成AS斑塊。AS因為其普及面廣，在人體內潛伏期長，最后往往以局部缺血、心絞痛、心肌梗塞、中風、冠心病或心力衰竭等致命病的形式爆發。從根本上說心腦血管事件的發生很大程度上取決于AS斑塊的穩定性。Lp-PLA2活性反應動脈粥樣硬化病變程度，與易損斑塊的穩定性有關，相對于穩定性斑塊，不穩定斑塊的Lp-PLA2的活性明顯升高。Lp-PLA2與其他炎性因子如C-反應蛋白等相比，因受其他危險因素的影響較小，繼而檢測具有更高的靈敏度和特異性。

CRP是一種Υ球蛋白，分子量為105KD，，是在感染和組織損傷時血漿濃度快速，急劇升高的主要的急性期蛋白。CRP可以激活補體和加強吞噬細胞的吞噬而起調理作用，從而清除入侵機體的病原微生物和損傷，壞死，凋亡的組織細胞，在機體的天然免疫過程中發揮重要的保護作用。1930年，研究人員發現，某些急性感染患者的血清能與肺炎鏈球菌莢膜C多糖發生沉淀反應，并證實造成沉淀反應的是一種蛋白質，且急、慢性炎癥均存在此種反應。這種非特異性炎癥蛋白被稱為C-反應蛋白（CRP）。CRP由5個含206個氨基酸的相同單體以非共價鍵構成，蛋白的排列類似淀粉樣蛋白P.CRP結構中含結晶樣的鈣結合環，一個亞單位與另一個亞單位的鈣部位相連成五聚體結構。CRP由炎性淋巴因子刺激肝臟和上皮細胞合成，目前尚未發現CRP先天性缺乏。CRP通過終末協調復合物（C5b-9）參與早期AS的形成。在斑塊表面的脆弱部位，單核細胞（巨噬細胞）、T淋巴細胞大量滲入，使斑塊不穩定而破裂。在此過程白細胞介素（IL）-6引起肝臟合成CRP增加。動脈粥樣硬化(atherosclerosis)斑塊內CRPmRNA較正常動脈和肝臟中高7～10倍。AS斑塊內激活的補體和CRP,使斑塊不穩定和破裂，最終導致血栓形成。因此，升高的CRP有引起血栓形成的危險。臨床上超敏C反應蛋白（hs-CRP）在嚴重冠心病猝死患者中顯著升高，hs-CRP與免疫組化染色的AS薄帽的強度和數量有關。總之，hs-CRP與AS的程度密切相關，成為反映AS炎性活動的指標。

將兩者結合，進行聯合檢測可以更加準確有效地評估AS的嚴重性，診斷心肌損傷及其程度。

Lp-PLA2在臨床上的檢測方法，主要有免疫比濁法、化學發光法、酶聯免疫法及膠體金法。hs-CRP的檢測方法有單向免疫擴散法、膠乳凝集法、酶聯吸附法、速率散射比濁法等。膠體金法是最為常用的快速檢測手段之一。因此，采用膠體金法，開發一快速、簡便、準確并且費用低廉的心腦血管疾病的診斷試劑盒具有重要的臨床意義。

發明內容