[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)口蹄疫病毒A型的引物、試劑盒、使用方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610343401.6
• 申請(qǐng)日: 2016-05-23
• 公開（公告）號(hào): CN105779657A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李海利;郎利敏;徐引弟;張青嫻;游一;蘭亞莉;藺萍;侯自花;徐照學(xué);馮亞杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41122
• 代理人: 王明朗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)口蹄疫病毒A型的引物、試劑盒、使用方法及其 應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

口蹄疫(aphthaeepizooticae；footandmouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒 引起的一種人獸共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，其臨診特征是在口腔 粘膜、四肢下端及乳等處皮膚形成水皰和爛斑。該病傳播迅速，流行面廣，成 年動(dòng)物多取良性經(jīng)過，幼齡動(dòng)物多因心肌受損而死亡率較高?？谔阋邚V泛流行 于世界各地，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，各國政府及國際組織高度重視，被列為 全球各國共同商定撲滅的頭號(hào)法定傳染病。隨著國際貿(mào)易的日趨增加，物質(zhì)交 流和國際交往越來越頻繁，給口蹄疫的預(yù)防和控制增加了難度，因此世界各國 都花費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力來研究、控制和消滅口蹄疫。

口蹄疫病毒(Foot-and-Mouthdiseasevirus)屬于微RNA病毒科中的口蹄疫 病毒屬，是RNA病毒中最小的一個(gè)。口蹄疫病毒具有多型性、易變異的特點(diǎn)。 根據(jù)其血清學(xué)特性，可以分為7個(gè)血清型，即A、O、C、SAT1(南非I)、SAT2 (南非II型)、SAT3(南非III型)及Asia1型(亞洲1型)。各個(gè)血清型間無交 叉免疫現(xiàn)象。每一個(gè)血清型又包含若干個(gè)亞型，同型各個(gè)亞型之間也僅有部分 交叉免疫性。該病毒的這種特性給口蹄疫的防制帶來了許多困難。

口蹄疫病毒在患病動(dòng)物的水皰液、水皰皮、淋巴液及發(fā)熱期血液內(nèi)的含量 最高，其次是各組織器官、分泌物、排泄物，可長(zhǎng)期存在并向外排毒，退熱后 病毒可以出現(xiàn)于乳、糞、尿、淚、涎水及各臟器中?？谔阋卟《緦?duì)外界環(huán)境的 抵抗力很強(qiáng)，耐干燥。在自然條件下，含毒組織及污染的飼料、飲水、飼草、 皮毛及土壤等所含病毒在數(shù)日乃至數(shù)周內(nèi)仍具有感染性。口蹄疫病毒對(duì)酸和堿 都特別敏感，在pH3.0和pH9.0以上的緩沖液中，病毒感染性將瞬間消失，2％～4％ 氫氧化鈉、3％～5％福爾馬林溶液、5％氨水、0.2％～0.5％過氧乙酸或5％次氯酸鈉 等均為口蹄疫病毒良好的消毒劑。

口蹄疫是一種傳染性極強(qiáng)的傳染病，一經(jīng)發(fā)生往往呈流行性，在牧區(qū)，多 呈現(xiàn)大流行，疫情一旦發(fā)生，可隨動(dòng)物的流動(dòng)迅速蔓延，經(jīng)過一定時(shí)期后疫情 才逐漸平息?？谔阋呖筛腥径喾N動(dòng)物，偶蹄目動(dòng)物易感性最高，易感性高低的 順序依次為黃牛、奶牛、牦牛、水牛、豬、羊、駱駝。

對(duì)于口蹄疫的防治目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防制措施及對(duì)癥 療法。最根本的辦法是消除患病動(dòng)物、帶毒動(dòng)物和徹底消毒，切斷傳播途徑。 因此應(yīng)加強(qiáng)檢疫和口蹄疫監(jiān)測(cè)，以防口蹄疫擴(kuò)散。

目前，根據(jù)流行病學(xué)、臨診癥狀和病例剖檢特點(diǎn)可以做出口蹄疫的初步診 斷，但確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。病毒的分離與鑒定和血清學(xué)診斷是實(shí)驗(yàn)室診 斷常用的方法，但較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，耗時(shí)較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測(cè)口蹄疫病毒A型的引物、 試劑盒、使用方法及其應(yīng)用，采用本發(fā)明的試劑盒，能夠在三個(gè)小時(shí)內(nèi)做出診 斷，為口蹄疫臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供一種有效的分子生物學(xué)診斷方 法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種用于檢測(cè)口蹄疫病 毒A型的引物，所述的引物為引物對(duì)FMDA，其中，

上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′

下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。

一種用于檢測(cè)口蹄疫病毒A型的試劑盒，所述的試劑盒包括引物對(duì)FMDA， 其中，

上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′

下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。

所述的試劑盒還包括5×RTBuffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn) 錄酶、超純水、裂解液和沖洗液。

所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

所述的裂解液的組分為：羥基喹啉3～5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸三氯乙酯 3.2～5.2μM、異硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 氯化鈉0.3～0.5M和檸檬酸鈉0.6～0.9M。

所述的沖洗液的組分為：三羥甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙 醇60～80％(體積分?jǐn)?shù))；pH7.0。