[發明專利]一株吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株YH5及其應用

有效

• 申請號: 201610324646.4
• 申請日: 2016-05-17
• 公開（公告）號: CN105754954B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 胥傳來;姚蕾珺;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株YH5及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明吡蟲啉完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化完全，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐劑，多次加強免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐劑，最后一次用吡蟲啉完全抗原（25μg/只，不含佐劑）沖擊免疫。取高效價低IC₅₀小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，經過間接競爭酶聯免疫法篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤細胞株。此細胞株分泌的單克隆抗體，對吡蟲啉具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC₅₀值為0.3 ng/mL），可實現對水、果蔬、谷物中吡蟲啉殘留量的檢測，為食品中吡蟲啉殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及一株吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株YH5及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

吡蟲啉是一種新型的硝基亞甲基類的高效內吸性廣譜殺蟲劑，屬新煙堿類藥物，是煙堿型乙酰膽堿受體的作用體，目前在農業生產中已廣泛使用，屬低毒類殺蟲劑，對蜜蜂的毒性為高毒。2002年，意大利北部和法國一些地區在使用吡蟲啉過程中出現蜜蜂大量消失的現象，新煙堿類藥物屬于神經毒素，可以阻礙蜜蜂及其他昆蟲大腦中的感受器接收神經信號。

2012年木村黑田（Kimura-Kuroda）等人在PLoS One雜志上發表的一篇科學論文，提出吡蟲啉的暴露可能會對哺乳動物神經系統的發育產生影響。歐盟食品安全局（EFSA）針對此論文分析發現，吡蟲啉可能會對人類發育中的神經系統造成影響。在EFSA審查發現吡蟲啉對蜜蜂有害之后，近兩年歐盟已限制該藥在一些作物上的使用（《Agrow》No.665，p6）。建立針對吡蟲啉的快速、準確和靈敏的檢測方法很有必要。

目前檢測吡蟲啉色譜法應用最為廣泛，包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質聯用(GC-MS)、液質聯用 (LC-MS)、超臨界流體色譜(SFC)、毛細管電泳(CE)等的儀器方法，但這些方法需要昂貴的儀器、專業的操作人員，且樣品前處理復雜，成本高，時間長，不能實現大量樣品的快速檢測，因此建立快速簡便的吡蟲啉檢測方法具有重要意義。酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。建立高效的免疫學檢測方法，篩選高特異性的單克隆抗體是重要前提。

發明內容

本發明的目的是提供一株吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對吡蟲啉具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立吡蟲啉的免疫學檢測方法。

本發明的技術方案，一株吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株YH5，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.12015。

吡蟲啉單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.12015的吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株YH5分泌產生。

所述吡蟲啉單克隆抗體的應用，用于食品安全檢測中吡蟲啉殘留的分析檢測。

本發明提供的吡蟲啉單克隆抗體雜交瘤細胞株YH5的制備基本步驟為：

1）半抗原的合成：

將吡蟲啉原藥1(2 g，7.82 mmol），巰基丙酸（1.66 g，2 eq），Cs₂CO₃（25.5g，10 eq）混懸于己二酸二甲酯（30 mL）中，120℃下反應16 h，冷至室溫，加入四氫呋喃（50 mL）后過濾，所得固體粗品（30g）加入少量水中，prep-HPLC純化，最后得到100mg半抗原IMPA。用液質聯用分析法進行鑒定與分析；