[發明專利]多年生黑麥草表皮細胞切片的制備方法

有效

• 申請號: 201610306304.X
• 申請日: 2016-05-10
• 公開（公告）號: CN107219103B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 常智慧;孫碧徽;尹淑霞;韓烈保
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明涉及實驗用具，具體公開了一種多年生黑麥草表皮細胞切片的制備方法，所述方法包括：(1)選取多年生黑麥草葉片，投入FPA固定液中固定至少24小時，取出進行徒手切片，獲得待觀察多年生黑麥草葉片；(2)沖洗葉片表面殘留的固定液，刮去葉片一側表皮及部分葉肉后，投入濃度為0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃條件下解離1～3h后，清洗去除混合酶液；(3)刮去殘存組織，直至葉片表皮呈現透明狀，即得多年生黑麥草表皮細胞切片；其中，所述混合酶液中含有等質量比的果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶。通過本發明方法可以獲得完整且視野清晰的多年生黑麥草葉片表皮細胞切片，可以在顯微鏡下觀察到清晰的氣孔、表皮細胞結構、表皮毛等附屬器官。

技術領域

本發明涉及實驗用具領域，具體地說，涉及一種顯微觀察的細胞切片。

背景技術

多年生黑麥草是一種重要的冷季型草坪草種，原產于歐洲、溫帶亞洲和北非。黑麥草適宜無嚴冬酷夏的涼爽環境。作為草坪建植的重要草種之一，多年生黑麥草成坪快，耐低修剪，能夠形成致密的草皮，常作為冷季型混播草坪先鋒草種建植足球場草坪，也可以用作補播和交播材料。同時，葉片油亮，色澤墨綠的特點，也使其廣泛應用于景觀草坪、運動場草坪以及高爾夫球場球道草坪。由于多年生黑麥草應用廣泛，葉片形態與生理特性具有相關性，因此研究人員需要對其葉片表皮細胞進行觀察。

葉片表皮細胞特征觀察包括細胞數量、大小、形態、細胞分類(如：長細胞、短細胞)、表皮毛數量、大小、形態以及氣孔數量、大小、形態等特征的觀察。不同品種多年生黑麥草葉片表皮細胞形態存在一定的差異，而這種差異有可能造成不同品種多年生黑麥草間的生理抗性的差異。因此，觀察和研究多年生黑麥草表皮細胞具有重要的意義。

有大量研究人員通過直接刮取草坪草葉片表面制作徒手切片，觀察草坪草葉片表皮細胞。但這種方法并不適用于多年生黑麥草，多年生黑麥草葉片含水量較多，表皮細胞排列緊密，通過直接刮表皮無法獲得完整表皮細胞，同時，會存留大量葉綠素，影響視野清晰度及表皮細胞的完整性。

多年生黑麥草葉片表面含有蠟質，表皮毛等附屬器官，保護葉片表皮，因而使得葉片表皮切片的制作具有困難。透明膠帶法和指甲油印跡法都是通過利用透明膠帶和指甲油對葉片表面的粘合性撕取葉片表皮細胞，制成裝片進行顯微觀察。但這兩種方法缺點明顯，首先，多年生黑麥草葉片表皮蠟質較多，使得透明膠帶和指甲油對葉片表面的粘合性不強，無法獲取多年生黑麥草完整的表皮細胞；其次，撕取部分表皮細胞后，會將大量的葉綠素一同撕取下來，造成觀察過程中的視野阻礙，影響表皮細胞觀察清晰度。

次氯酸離析葉片表皮細胞的方法是通過離析法，離析葉片表皮細胞與葉肉，撕取表皮細胞后，進行染色，制成裝片觀察。此種方法的缺點為，使用次氯酸鈉會對多年生黑麥草葉片表皮細胞造成不可逆的損傷，破壞程度隨次氯酸鈉濃度的增加而加深，但離析效果同樣因次氯酸鈉濃度的增加效果更加顯著，這便造成了互相矛盾的結果。

因此，亟需開發一種適用于多年生黑麥草的葉片表皮細胞徒手切片制作方法，在對表皮細胞傷害程度盡可能小的基礎上，快速獲得完整、且視野內清晰度高的表皮細胞徒手切片。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種多年生黑麥草表皮細胞切片的制備方法。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明首先提供一種多年生黑麥草表皮細胞切片的制備方法，包括如下步驟：

(1)選取多年生黑麥草葉片，投入FPA固定液中固定至少24小時，取出進行徒手切片，獲得待觀察多年生黑麥草葉片，

(2)沖洗葉片表面殘留的固定液，刮去葉片一側表皮及部分葉肉后，投入濃度為0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃條件下解離1～3h后，清洗去除混合酶液；

具體而言，若欲觀察葉片上表皮，則刮去葉片下表皮及部分葉肉，若欲觀察葉片下表皮，則刮去葉片上表皮及部分葉肉；