[發(fā)明專利]一種比色檢測青蒿素及其衍生物的分析方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610303933.7
• 申請日: 2016-05-05
• 公開（公告）號: CN105784620A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余伯陽;田蔣為;李紀(jì)偉;沐春琪;李婭
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于比色分析和青蒿素及其衍生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種運用納米金和 單鏈DNA來定性、定量的比色檢測方法。

技術(shù)背景：

青蒿素是青蒿抗瘧的有效成分，也是合成青蒿素系列藥物的起始原料，當(dāng)前青蒿素系列 藥物已取代奎寧成為治療瘧疾最安全有效的藥物。近年來由于青蒿素及其衍生物在世界范圍 的廣泛應(yīng)用，促進(jìn)了我國青蒿素提取業(yè)的快速發(fā)展，同時也帶動了青蒿種植業(yè)的發(fā)展。因為 青蒿的使用量大，市場需求廣，一些不法商販也借機用劣質(zhì)青蒿或偽品冒充正品出售，給青 蒿素提取廠商帶來了很大的損失，因此建立青蒿素定性以及定量檢測方法顯得尤為重要。當(dāng) 前青蒿素的檢測方法包括生物學(xué)方法、光譜分析法、色譜分析法等。生物學(xué)方法如酶聯(lián)免疫 法(ELISA法)、放射免疫分析法(RIA法)，在定量分析青蒿素時通常會遇到成本高、操作復(fù) 雜等問題，不具有普遍性。光譜分析法如紫外光譜分析法，存在操作步驟煩瑣、費時的缺點。 色譜分析法如高效液相色譜法，雖具有準(zhǔn)確度高、專屬性強、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，但因儀器昂 貴，成本太高而不能普及和推廣。因此，建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的青蒿素檢測方 法勢在必行。

近年來，隨著新型納米材料的不斷出現(xiàn)，便攜、實時、低成本的檢測技術(shù)和裝備迅速發(fā) 展起來。其中，金納米粒子因其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)而收到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。納米金是指直 徑在0.5-250nm的金超微粒子，一般分散在水中。Mirkin等首次將納米金比色測定法應(yīng)用于 生理活性物質(zhì)分析，利用納米金溶液在聚集和解聚集過程中所產(chǎn)生的顏色變化，發(fā)展了肉眼 可視化分析檢測寡聚核苷酸雜交的DNA生物傳感器。這種基于納米金的裸眼可視化檢測方 法，其具有方便、快捷、靈敏度高、低成本、儀器簡單等顯著優(yōu)點，因而更適合于現(xiàn)場篩查 和現(xiàn)代社會對分析檢測技術(shù)的需求。迄今為止，將納米金用于青蒿素及其衍生物的可視化檢 測研究還未見報道。

青蒿素及其衍生物含有過氧橋基團，可與亞鐵反應(yīng)后可生成高活性自由基，破壞單鏈 DNA的結(jié)構(gòu)，而單鏈DNA對納米金可起穩(wěn)定作用。本發(fā)明基于這些研究，通過青蒿素及其 衍生物與亞鐵反應(yīng)生成自由基，破壞單鏈DNA，使其喪失對納米金的保護(hù)作用，使分散的納 米金聚集，顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，達(dá)到裸眼檢測青蒿素及其衍生物的目的。納米金溶液 顏色的變化對應(yīng)于吸光度的變化，納米金聚集使特征吸收峰紅移，以吸光度比值對濃度做標(biāo) 準(zhǔn)曲線，從而建立一種基于納米金比色檢測青蒿素及其衍生物的分析方法。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于克服當(dāng)下青蒿素及其衍生物檢測過程中存在的操作繁瑣費時、成本昂 貴、依賴大型儀器設(shè)備等問題，提供了一種基于納米金的新型比色檢測方法，利用了納米金 獨特的光學(xué)特性及青蒿素的特殊結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一個簡單快速靈敏的檢測體系。納米金膠體分 散狀態(tài)時呈酒紅色，聚集后呈藍(lán)紫色，單鏈DNA可防止納米金在亞鐵離子溶液中聚集，從 而對納米金膠體起到保護(hù)作用。而青蒿素或其衍生物在亞鐵離子催化下可產(chǎn)生自由基，破壞 單鏈DNA結(jié)構(gòu)，使其喪失對納米金的保護(hù)，進(jìn)而使納米金聚集變色，實現(xiàn)對青蒿素及其衍 生物的比色檢測。所述的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所涉及的比色檢測青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)分別向A、B離心管中加入單鏈DNA溶液；

(2)向步驟(1)中得到的B離心管溶液加入含有青蒿素或其衍生物的丙酮溶液，A離心管 加入等量丙酮溶液；

(3)向步驟(2)中得到的A、B離心管溶液分別加入亞鐵離子溶液并混合均勻，反應(yīng)一段 時間，當(dāng)青蒿素或其衍生物存在時將反應(yīng)產(chǎn)生自由基，從而破壞單鏈DNA，若不存在則沒有 自由基產(chǎn)生，單鏈DNA結(jié)構(gòu)保持完整；

(4)向步驟(3)中得到的A、B離心管溶液分別加入納米金膠體溶液并混合均勻，觀察到B 離心管中混合物顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，即指示了青蒿素或其衍生物的存在；而A離心管 混合物中不存在青蒿素或其衍生物，沒有自由基產(chǎn)生，納米金膠體得到了結(jié)構(gòu)完整的單鏈 DNA的保護(hù)，保持分散狀態(tài)的酒紅色；

(5)通過紫外分光光度計測定A、B離心管溶液的吸光度，當(dāng)B離心管溶液有青蒿素或 其衍生物存在時吸收峰紅移；

(6)配制梯度濃度的青蒿素或其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過上述步驟后依次測定吸光度， 以吸光度比值對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對樣品中青蒿素或其衍生物的含量 測定。