[發明專利]一種鑒定食品中擬枝孢鐮刀菌的檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201610265458.9
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN105671200A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 張梅
• 申請（專利權）人: 張梅
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體地說，本發明涉及一種用于鑒定食品中的擬枝 孢鐮刀菌的LAMP檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides)屬于枝孢組鐮刀菌，菌絲生長迅速， 氣生菌絲旺盛，菌落呈放射狀，白色至粉紅色，菌落背面酒紅色至紅褐色。氣生菌絲上產生 有復雜分枝的分生孢子梗，其中大型分生抱子呈鐮刀形或紡錘型，通常為3-5個分隔，略彎 曲，寄主有黃瓜、玉米、棉花、番癡、辣椒等。

擬枝孢鐮刀菌能夠產生對人、畜威脅很大的鐮刀菌毒素，包括T-2毒素，后者是單 端孢霉烯族化合物中的A族，是該類化合物中毒性最強、污染水平較高的毒素之一，可以抑 制DNA、RNA及蛋白質合成，誘導細胞凋亡，引起白細胞缺乏等。人類誤食了大量污染該類毒 素的谷物或蔬菜后，除表現嘔吐、腹痛、腹瀉等急性癥狀外，可有白細胞缺乏、壞死性咽峽 炎、骨髓發育不良、食管和胃嚴重壞死等，病死率高(死亡率高達50％-60％)。二戰期間前西 伯利亞阿穆爾地區數千人因進食了被鐮刀菌污染的越冬小麥而發生食物中毒。蔣兆光等曾 報道過因食用感染擬枝孢鐮刀菌的飼料玉米而導致黃牛中毒的案例。因此，出于食品安全 的考慮，有必要開發出檢測食品中是否存在擬枝孢鐮刀菌的方法或試劑盒。

環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA, LAMP)是日本學者Notomi于2000年建立的一種新型的核酸擴增技術。該技術針對靶基因6個 區域設計4條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在恒溫條件下快速、高特異性地擴增 靶基因,產物是兩端帶有莖環結構的啞鈴狀DNA分子。與實驗室常規檢測的PCR方法相比， LAMP技術具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優勢，在食品、動植物檢驗檢疫中被廣泛應 用于各種病原檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于鑒定食品中的擬枝孢鐮刀菌的LAMP檢測試劑盒 及檢測方法。

為了實現本發明的目的，在一個方面中，本發明提供一種用于鑒定食品中的擬枝 孢鐮刀菌的LAMP檢測試劑盒，其包括特異性引物組、反應緩沖液、BstDNA聚合酶和核酸染 料，其中所述特異性引物組的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：CCACATCTTCGGGTCTGTTG(SEQIDNO:1)

外引物B3：CCTTGGTGCCAACTTCCATT(SEQIDNO:2)

內引物FIP：TGGGAAACGGGCATTTGCTTG-CAGTGCCAAG

TCAGCTCAT(SEQIDNO:3)

內引物BIP：ACCATATTCGAAAGCGGACGCG-GCAGTCTGGG

TAACGACAG(SEQIDNO:4)。

優選地，所述反應緩沖液由2mMdNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、0.6mM甜菜堿和 6mMMg²⁺組成。

優選地，所述核酸染料為1000×SYBRGreenI。

優選地，本發明的試劑盒進一步包括DNA提取試劑以及陽性對照和陰性對照，所述 DNA提取試劑例如CTAB抽提緩沖液。

在另一個方面中，本發明提供了特異性引物組在制備用于鑒定食品中的擬枝孢鐮 刀菌LAMP試劑盒中的應用。所述特異性引物組如序列SEQIDNOs:1-4所示。

在又一個方面中，本發明還提供一種鑒定食品中的擬枝孢鐮刀菌的LAMP檢測方 法，其中使用本發明的擬枝孢鐮刀菌的LAMP檢測試劑盒，所述方法包括以下步驟：

(1)向待測樣品中加入CTAB抽提緩沖液，按照常規CTAB法提取DNA；

(2)在PCR管中制備25μl反應體系，其包括0.2μmol/μl的外引物F31μl、0.2μmol/μ l的外引物B31μl、1.2μmol/μl的內引物FIP1μl、1.2μmol/μl的內引物BIP1μl、反應緩沖 液2.5μl、8U/μl的BstDNA聚合酶1μl、模板DNA2μl，加水補充至25μl，并以擬枝孢鐮刀菌基 因組DNA作為陽性對照，以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作為陰性對照；

(3)將步驟(2)中的PCR管于63℃恒溫反應60min；