[發明專利]一種豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201610259598.5
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105734175A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 秦毅斌;劉磊;盧冰霞;何穎;趙武;段群棚;陳忠偉;李斌;周英寧;梁家幸;楊思儀;蔣冬福;蘇乾蓮
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定量檢測豬輪狀病毒的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。

背景技術

輪狀病毒(Rotavirus,RV)屬呼腸病毒科，輪狀病毒屬，為雙股正鏈RNA，分為A、B、C、D、E和F6個群，在發生腹瀉的動物中最常見的是A群，感染豬的RV有A群、B群、C群和E群。RV于1968年由美國的MebusMS等首次從犢牛糞便中分離成功，后來發現其可用非洲綠猴腎原代細胞進行培養。ElAttarL等試驗結果表明，在適宜的條件下，感染某種動物的輪狀病毒會因一種致病的適應輪狀病毒給其他不同種屬動物帶來感染隱患，例如在犢牛和豬、人和豬之間可交叉感染。該病主要以厭食、嘔吐、腹瀉和脫水、體重減輕為特征，對人類健康和畜牧業發展都有較大危害。自1974年Woode等在英國首次報道豬的RV后，RV在豬群中的傳播引起了許多國家的重視，接著澳大利亞、北愛爾蘭、美國、法國等均有RV引起仔豬腹瀉的報道。據報道，美國斷奶仔豬感染陽性率為80%，病死率為15%，當有混合感染時，病死率更高。中國自1982年從腹瀉豬糞便中分離到RV，證實豬RV感染在我國普遍存在。該病可以引起仔豬的死亡、成年豬的掉膘、飼料報酬的降低、增加人工費和藥費的開支等，在豬病毒性腹瀉中由RV造成的損失僅次于豬流行性腹瀉病毒（TGEV），所以國內外非常重視的對RV的防制。

對豬輪狀病毒的快速準確診斷，不僅有利于養殖場對該病做出正確的防制措施，而且有利于其他豬消化道疾病的防治以及防止該病毒在病畜和人之間的交叉傳播。目前實驗室診斷RV的方法大致可分為2類：①血清學方法，如ELISA方法、血清中和實驗、免疫熒光等；②分子生物學方法。血清學方法存在假陽性過多的問題和現象，并且不適于RV急性感染的早期做出快速準確的診斷。分子生物學方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，雖然PCR方法較病毒分離鑒定方法快速準確，但需要昂貴的儀器設備，成本較高，在結果判定上需要進行瓊脂糖凝膠電泳，容易造成實驗室污染導致出現假陽性結果，用時也較長，不適合基層和現場檢測。

發明內容

本發明的目的是為了解決基層檢測豬輪狀病毒困難、耗時長和儀器昂貴等問題，提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測豬輪狀病毒的試劑盒，為實現本發明目的所使用的技術方案為：一種豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括RT-LAMP引物、2×反應緩沖液、EM、熒光目視檢測試劑、超純水和豬輪狀病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）與B3（SEQIDNO：2）、內引物FIP（SEQIDNO：3）與BIP（SEQIDNO：4）和環引物LF（SEQIDNO：5）與LB（SEQIDNO：6）；

其中：

F3CATCTGATTACATTGAGAATTGG

B3TGCATTAAAAGCACACGAAT

FIPAGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA

BIPTAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA

LFGGCTTATGGAACACGAATCCAG

LBTTAATGGGGACTATGTGGATTAACG；

所述的2×反應緩沖液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的豬輪狀病毒RNA模板是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取的豬輪狀病毒的RNA。

以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。

以上所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgSO₄15-20mM、(NH₄)₂SO₄15-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH為8.7條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。

一種豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，用于獸醫臨床上檢測疑似豬輪狀病毒病變組織、豬糞便排泄物或培養物中是否含有豬輪狀病毒，具體檢測步驟包括：

（1）RT-LAMP引物的設計與合成