[發明專利]一種豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201610259598.5
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105734175A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 秦毅斌;劉磊;盧冰霞;何穎;趙武;段群棚;陳忠偉;李斌;周英寧;梁家幸;楊思儀;蔣冬福;蘇乾蓮
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

1.一種豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括RT-LAMP引物，其引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）與B3（SEQIDNO：2）、內引物FIP（SEQIDNO：3）與BIP（SEQIDNO：4）和環引物LF（SEQIDNO：5）與LB（SEQIDNO：6）；

其中：

F3CATCTGATTACATTGAGAATTGG

B3TGCATTAAAAGCACACGAAT

FIPAGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA

BIPTAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA

LFGGCTTATGGAACACGAATCCAG

LBTTAATGGGGACTATGTGGATTAACG。

2.根據權利要求1所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括2×反應緩沖液、EM、熒光目視檢測試劑、超純水和豬輪狀病毒RNA模板；所述的2×反應緩沖液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

3.根據權利要求2所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。

4.根據權利要求2所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgSO₄15-20mM、(NH₄)₂SO₄15-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM。

5.根據權利要求2所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，具體操作步驟包括：

（1）RT-LAMP引物的設計與合成

（2）豬輪狀病毒RNA模板的提取

（3）RT-LAMP反應體系的建立

（4）RT-LAMP檢測方法。

6.根據權利要求5所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的RT-LAMP反應體系建立以25μL計，

2×反應緩沖液12.5μL

EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

LF20pmol

LB20pmol

F35pmol

B35pmol

豬輪狀病毒RNA5μL

超純水補足25μL。

7.根據權利要求5所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的RT-LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。

8.根據權利要求5所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的RT-LAMP檢測方法采用實時濁度儀進行密閉全程監控。

9.根據權利要求5所述的豬輪狀病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的LAMP檢測方法反應溫度為63℃，反應在20-30分鐘出現擴增。