[發明專利]一種基于核酸適配體的酶聯免疫吸附技術檢測石斑魚虹彩病毒感染的方法

在審

• 申請號: 201610259525.6
• 申請日: 2016-04-22
• 公開（公告）號: CN105785024A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 秦啟偉;李鵬飛;魏世娜;周伶俐
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

技術領域：

本發明屬于石斑魚虹彩病毒檢測領域，具體涉及一種基于核酸適配體的酶聯免疫 吸附技術檢測石斑魚虹彩病毒感染的方法。

背景技術：

石斑魚是我國南方沿海各省以及東南亞各國最名貴的海水養殖魚類之一，經濟價 值極高。但近年來在石斑魚中暴發和流行的石斑魚虹彩病毒(Singaporegrouper iridovirus,SGIV)嚴重地威脅著石斑魚的海水養殖，造成了巨大的經濟損失。石斑魚在被 SGIV感染后，會出現黑體、肝脾腎等組織器官壞死腫大，最終導致魚體死亡。對于高密度養 殖的石斑魚而言，能夠在石斑魚虹彩病毒感染的早期進行快速檢測且操作簡便的技術方 法，對于控制SGIV感染、減少損失至關重要。目前對于石斑魚虹彩病毒診斷的方法主要包括 基于病毒學、組織病理學的傳統方法，基于抗體的免疫學檢測方法，以及分子生物學技術 等。盡管這些檢測SGIV感染的方法具備高敏感性、高準確性的特點，但是由于試劑和實驗儀 器昂貴，需要專業人員來操作且檢測步驟繁瑣，耗時長且試劑保存條件苛刻等缺點，導致這 些方法僅適用于實驗室條件下的檢測。因此亟需發展新型的高特異性、高靈敏性、操作簡便 的技術來監測和控制石斑魚虹彩病毒感染。

酶聯免疫吸附技術(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)目前廣泛應用 于有害微生物的檢測。但是傳統的基于抗體的ELISA檢測技術具有一些不足，例如抗體需要 嚴格的低溫保存條件以及抗體制備的耗時長、費用高、批次間質量存在差異，使用ELISA檢 測時首先用一抗結合后還要帶標記的二抗孵育，導致操作繁瑣耗時長。因此，尋找抗體的替 代物并簡化檢測技術的操作流程成為優化ELISA技術的主要途徑。指數富集的配基系統進 化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)是一類 廣受關注的新型檢測和治療的生物文庫技術。利用SELEX技術篩選得到的核酸適配體，即單 鏈DNA(ssDNA)或RNA，具有與單克隆抗體相當的高特異性和親和性，方便保存和運輸，溫度 變化引起的變性是可逆的，篩選時間短費用低，可以重復使用，而且得到的核酸適配體在后 期易于合成和修飾。在先前的工作中，我們基于指數富集配基進化技術，以被虹彩病毒感染 的石斑魚脾細胞為靶標進行篩選，獲得了可以高特異性的識別虹彩SGIV感染的核酸適配 體。

發明內容：

為了克服現有的基于抗體的、檢測病毒感染的酶聯免疫吸附技術的不足，本發明 的目的是提供一種高特異性、高靈敏度、操作便捷、適用于在養殖場中使用的基于石斑魚虹 彩病毒核酸適配體的酶聯免疫吸附技術(Aptamer-basedenzyme-linkedapta-sorbent assays,Apt-ELISA)檢測石斑魚虹彩病毒感染的方法。

本發明的基于核酸適配體的酶聯免疫吸附技術檢測石斑魚虹彩病毒感染的方法， 其特征在于，包括以下步驟：

(1)、將SEQIDNO.1～3所示的任意一條生物素標記的石斑魚虹彩病毒核酸適配 體與待測樣品進行結合，然后清洗；

(2)、將步驟(1)中結合了核酸適配體的樣品進行離心，移除上清，將富集到的樣品 與辣根過氧化物酶-鏈霉親和素(HRP-streptavidin)混勻進行結合；

(3)、步驟(2)得到的結合了辣根過氧化物酶-鏈霉親和素的樣品進行清洗，然后移 入酶標板中，每孔加入TMB顯色液避光反應，最后加入終止液終止反應；

(4)、檢測待測樣品在450nm處的吸光值，根據吸光值的變化來判斷樣品室是否被 石斑魚虹彩病毒感染。

優選，步驟(1)的生物素標記的石斑魚虹彩病毒核酸適配體與待測樣品結合前先 進行復性，具體為：將生物素標記的核酸適配體在94℃高溫變性10min，然后迅速插入到冰 中復性10min。

步驟(1)所述的核酸適配體與待測樣品結合，優選，200nM的核酸適配體與200μl的 待測樣品結合。

步驟(1)所述的結合，優選，結合時間為1～30min，結合溫度為4～37℃。

步驟(1)所述的清洗，優選，用PBS清洗3次。

步驟(2)所述的辣根過氧化物酶-鏈霉親和素，優選，辣根過氧化物酶：鏈霉親和素 的體積比為1:10000，添加量為200μl，結合時間為15min。