[發(fā)明專(zhuān)利]一種同時(shí)檢測(cè)沙丁胺醇和氟甲喹的免疫層析試紙條及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610257516.3
• 申請(qǐng)日: 2016-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105738582B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冰;童貝;生威;張燕;王碩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/02;G01N33/558
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11401
• 代理人: 李明卓

1.一種同時(shí)檢測(cè)沙丁胺醇和氟甲喹的免疫層析試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背板，在PVC背板上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其中結(jié)合墊一半覆蓋在硝酸纖維素膜上，樣品墊部分覆蓋于結(jié)合墊上，吸水墊部分覆蓋于硝酸纖維素膜上；所述的硝酸纖維素膜上平行設(shè)置一條質(zhì)控線和兩條檢測(cè)線，所述的結(jié)合墊上包被有抗體-膠體金標(biāo)記物；所述的硝酸纖維素膜上分別包被有羊抗兔二抗構(gòu)成的質(zhì)控線，沙丁胺醇抗原構(gòu)成的檢測(cè)線a和氟甲喹抗原構(gòu)成的檢測(cè)線b，其特征在于，所述試紙條制備包括如下步驟：

(1)沙丁胺醇抗血清和氟甲喹抗血清純化，得到沙丁胺醇多克隆抗體和氟甲喹多克隆抗體；

(2)分別采用碳二亞胺法和混合酸酐法制備沙丁胺醇抗原和氟甲喹抗原；

(3)采用檸檬酸三鈉還原法制備20nm左右膠體金和用硼酸鹽緩沖溶液配制膠體碳；

采用檸檬酸三鈉法制備膠體金：先取200mL去離子水倒入用于制備膠體金的三角瓶中，于恒溫電磁攪拌器上加熱至沸騰一分鐘進(jìn)一步清洗之后，小心倒掉沸水，取濃度為0.01％HAuCl₄水溶液，水溶液已過(guò)0.22μm水系膜，100mL倒入三角瓶，加熱到沸騰， 沸騰后，快速小心加入2.25mL 1％的檸檬酸三鈉水溶液，檸檬酸三鈉水溶液已過(guò)0.22μm水系膜，2分鐘內(nèi)觀察到明顯的顏色變化，當(dāng)膠體金溶液呈現(xiàn)穩(wěn)定的顏色不再變化時(shí)繼續(xù)煮沸15分鐘，室溫冷卻后用去離子水定容至100mL，轉(zhuǎn)移至清洗過(guò)的玻璃瓶中4℃保存?zhèn)溆茫苽浜玫哪z體金溶液清亮透明，呈酒紅色，表面無(wú)漂浮物；

膠體碳的制備：

將炭黑分散到硼酸鹽緩沖溶液中，超聲20min，得到分散均勻的膠體溶液，且其濃度為0.5mg/mL；

(4)將步驟(1)純化的沙丁胺醇多克隆抗體20μg和氟甲喹多克隆60μg分別加入到步驟(3)制備的1mL膠體金和300μL膠體碳中，制備抗體-膠體金標(biāo)記物和抗體-膠體碳標(biāo)記物；

沙丁胺醇抗體—膠體金標(biāo)記物的制備：

按每mL膠體金加入20μL 0.2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值，然后按每mL膠體金加入20μg沙丁胺醇抗體，輕微振搖使其混勻，4℃靜置60分鐘，然后按每mL膠體金中加入20μL 20％的BSA以封閉膠體金表面多余的殘基，室溫靜置30分鐘后，再向其中加入10μL 20％的PEG2000后室溫靜置30分鐘，4℃條件下2000rpm低速離心15分鐘棄沉淀取上清，將上清于4℃條件下10000rpm高速離心30分鐘，棄去上清液，向得到的沉淀中加入200μL膠體金標(biāo)記抗體稀釋液稀釋6倍，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

氟甲喹抗體-膠體碳標(biāo)記物的制備：

用硼酸鹽緩沖溶液將氟甲喹抗體稀釋至0.5mg/mL；在緩慢攪拌條件下將抗體加入到膠體碳溶液中，然后于4℃冰箱內(nèi)緩慢攪拌過(guò)夜；用緩沖液14000r/min，10℃，30min洗滌碳標(biāo)抗體3次，最后沉淀用緩沖液重懸至最初體積，并控制抗體的濃度在250μg/mL與100μg/mL之間，4℃保存?zhèn)溆茫皇褂们霸儆门鹚猁}緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)?/p>

(5)將步驟(4)制備的抗體-膠體金標(biāo)記物稀釋5倍，包被于結(jié)合墊上；

以30μL/cm將沙丁胺醇抗體—膠體金標(biāo)記物包被于結(jié)合墊上，真空干燥；

(6)將步驟(2)制備的沙丁胺醇抗原和氟甲喹抗原分別稀釋8倍和5 倍包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測(cè)線a和檢測(cè)線b，并將羊抗兔二抗稀釋120倍包被于硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線；

用上海金標(biāo)的雙維平面劃膜儀將制備的沙丁胺醇抗原和氟甲喹抗原分別稀釋8倍和5倍包被于硝酸纖維素膜3上作為檢測(cè)線a、檢測(cè)線b，包被量為0.9μL/cm；將購(gòu)買(mǎi)的羊抗兔二抗稀釋120倍包被于硝酸纖維素膜3上作為質(zhì)控線7，包被量為0.9μL/cm，37℃烘干；

(7)在PVC背板上按順序依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，得到所述的檢測(cè)沙丁胺醇和氟甲喹的試紙條；

(8)將沙丁胺醇和氟甲喹混合配制成一系列梯度的標(biāo)品溶液，取稀釋后的膠體碳標(biāo)記的抗體與混合標(biāo)品溶液，混合均勻后滴加到加樣孔中，10min后觀察結(jié)果。