[發(fā)明專利]誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的組合物和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610230257.5
• 申請日: 2016-04-14
• 公開（公告）號: CN105695402A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 安沂華;董健伸
• 申請（專利權）人: 安沂華
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 北京律遠專利代理事務所(普通合伙) 11574
• 代理人: 丁清鵬

1.一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的組合物，該組合物 包含：20-80μML-抗壞血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM 地塞米松，10-50μg/ml維生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml 吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮 酯，所述濃度是指在培養(yǎng)基中的濃度：

2.根據權利1所述的組合物，該組合物包含：50μg/mlL-抗壞血 酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml維生素C， 20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I) 所示的氯地孕酮酯。

3.根據權利要求1或2所述的組合物，該組合物還包含10-100 μM的β-甘油磷酸鈉。

4.根據權利要求1或2所述的組合物，該組合物還包含50-200 μM雪蓮和/或藏紅花的提取物。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，該組合物用作培養(yǎng) 基或培養(yǎng)液的成軟骨誘導劑。

6.根據權利要求5所述的組合物，所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)液包括 DMEM培養(yǎng)液、α-MEM培養(yǎng)液中的任一種。

7.一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，該方法包括： 在15ml尖底離心管中使用小球法誘導培養(yǎng)間充質干細胞，并且每隔 約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離，使用的誘導 分化培養(yǎng)基為高糖DMEM中加入權利要求1-3所述組成和濃度的組 合物。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，誘導分化培養(yǎng)時間為14-21 天。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其中，所述間充質干細胞 為臍帶源間充質干細胞或骨髓間充質干細胞。

10.根據權利要求7或8所述的方法，該方法包括以下步驟：

1)充質干細胞為臍帶源間充質干細胞，其中，在每個75cm²培 養(yǎng)瓶中加入13.5ml間充質干細胞生長培養(yǎng)基培養(yǎng)P3代臍帶源間充質 干細胞，細胞生長達到70-80％融合，用D-Hank’s洗液洗兩遍后， 加入1.5ml胰酶-EDTA進行消化，顯微鏡下觀察，細胞呈現圓球狀態(tài) 時，用1.5ml人血清終止消化，將細胞吸入50毫升離心管中，充分 混勻后，取200微升計數確定細胞數量，其余細胞懸液離心，1000rpm， 維持10min；倒掉離心后的上清，以1:3的比例傳代，培養(yǎng)至P4代， 細胞生長達到70-80％融合，用D-Hank’s洗液洗兩遍后，加入1.5ml 胰酶-EDTA進行消化，顯微鏡下觀察，細胞呈現圓球狀態(tài)時，用1.5ml 人血清終止消化，將細胞吸入50毫升離心管中，充分混勻后，離心， 1000rpm，10min；倒掉離心后的上清，加入30mlD-hank’s洗液， 混勻后再次離心，倒掉上清，再次加入30mlD-hank’s洗液，混勻 后，取出200微升計數，其余細胞懸液離心，1000rpm，10min；離 心后去掉上清；其中，所述間充質干細胞生長培養(yǎng)基為DMEM/F12 加入10％人血清、20ng/mlEGF、5ng/mlFGF2；

2)用間充質干細胞生長培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度至1× 10⁶細胞/ml；

3)小球法誘導培養(yǎng)細胞：將1ml含有1×10⁶個細胞的細胞懸液加入 15ml尖底離心管中，240g離心5分鐘，將離心管放入37℃，5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中，約24小時后，輕輕晃動離心管，使細胞球與管底分 離，之后換加入誘導分化培養(yǎng)基，所述誘導分化培養(yǎng)基為高糖DMEM 中加入權利要求1-3所述組成和濃度的組合物；每隔24小時輕輕晃 動離心管一次，使細胞球與管底分離，每兩天更換一次誘導分化培養(yǎng) 基；21天后，取出小球。