[發(fā)明專利]一種N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶、編碼基因及其高產(chǎn)菌株和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610218673.3
• 申請(qǐng)日: 2016-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN105754899B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何冰芳;張勁松;周有治;儲(chǔ)建林;劉柯;劉高飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/63;C12P19/38;C12P19/40;C12R1/225
• 代理公司: 南京匯盛專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32238
• 代理人: 袁靜

本發(fā)明提供一種N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶、編碼基因及其高產(chǎn)菌株和應(yīng)用，涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株，其分類命名為希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)ZJS01，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2015686。本發(fā)明還提供所述菌株產(chǎn)生的N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶及編碼所述N?脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的基因。本發(fā)明還提供含有所述基因的重組表達(dá)載體或重組菌及其在合成脫氧核苷中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶、編碼基因及其高產(chǎn)菌株和應(yīng)用。

技術(shù)背景

腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，盡管迄今尚未發(fā)現(xiàn)根治腫瘤的藥物，但自1943年氮芥用于治療惡性淋巴瘤后，幾十年來抗癌化療取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。其中核苷類似物是一類重要的抗癌化療劑，包括各種嘌呤和嘧啶核苷的衍生物。嘧啶核苷類似物中脫氧胞苷類似物是一類重要的抗癌化療劑，其主要是嘧啶核苷的衍生物，如阿糖胞苷、吉西他濱、曲殺他濱、地西他濱等。

地西他濱是一類新型的核苷類似物抗癌化療劑，是天然核苷2'-脫氧胞苷類似物。地西他濱是一類β-型異構(gòu)體，它是經(jīng)過在母體脫氧核糖支鏈的異頭碳上引入嘧啶類堿基而形成的物質(zhì)。該藥物分別于2006年4月和5月由歐洲EMEA和美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性骨髓增生異常綜合癥。地西他濱經(jīng)磷酸化后轉(zhuǎn)化為5'-單磷酸脫氧胞苷類似物，在DNA聚合酶作用下直接摻入至DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中，抑制DNA的合成及甲基化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。它在體外不能抑制DNA的合成，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)能引發(fā)低甲基化，且有維持基因的相關(guān)細(xì)胞分化和增殖控制功能。由于特殊的藥物作用機(jī)制，地西他濱引起了廣大學(xué)者的研究興趣。

核苷類化合物傳統(tǒng)的合成方法多為化學(xué)合成法，步驟繁多，并且最終的轉(zhuǎn)化率不高，產(chǎn)物成分復(fù)雜，分離純化難度大。N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶催化脫氧核糖從嘌呤(或嘧啶)脫氧核苷直接轉(zhuǎn)移到嘌呤(或嘧啶)核苷。利用N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶為催化劑催化合成脫氧核苷，例如地西他濱，整個(gè)反應(yīng)只需一步即可完成，但是，現(xiàn)有N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的催化效率較低，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率較低，難以產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株，產(chǎn)生的N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶能夠用于高效制備脫氧核苷。

本發(fā)明的另一目的是提供N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因，該酶能夠用于高效制備脫氧核苷。

本發(fā)明的再一目的是提供所述N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶在合成脫氧核苷中的應(yīng)用，產(chǎn)物的產(chǎn)率較高。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先從本實(shí)驗(yàn)室菌庫中獲得一株N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌，分類命名為希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)ZJS01，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M 2015686。

本發(fā)明對(duì)希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)ZJS01的生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定，該菌株為革蘭氏陽性菌株，無芽孢的桿菌，厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為25～35℃。其生理生化特性表現(xiàn)在：發(fā)酵葡萄糖和果糖，通常不發(fā)酵其他碳水化合物。

經(jīng)16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)。

本發(fā)明進(jìn)一步分離克隆到希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)ZJS01菌株所產(chǎn)N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的編碼基因，全長(zhǎng)483個(gè)堿基，具體如SEQ ID NO:1所示。該酶具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列，為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供了優(yōu)良的基因材料。希氏乳桿菌(Lactobacillus hilgardii)ZJS01菌株所產(chǎn)N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶命名為N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶NDT。