[發(fā)明專利]用于定量檢測鈣衛(wèi)蛋白的試紙條及其制備方法和鈣衛(wèi)蛋白濃度的測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610206931.6
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105785041A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付國亮;段學(xué)軍
• 申請（專利權(quán)）人: 付國亮
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京國之大銘知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11565
• 代理人: 李卉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測人鈣衛(wèi)蛋白(鈣衛(wèi)蛋白)的 免疫層析試紙條及其制備方法和鈣衛(wèi)蛋白(鈣衛(wèi)蛋白)濃度的即時快速測定方法。

背景技術(shù)

鈣衛(wèi)蛋白(Calprotectin)是分子量為36kD的鈣、鋅結(jié)合蛋白。由兩條分子量為 14kD的重鏈和一條分子量為8kD的輕鏈以共價鍵連接的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)異三聚體組成。

鈣衛(wèi)蛋白被認(rèn)為是多種疾病中可靠的炎癥指標(biāo)，它可以清楚的區(qū)分器質(zhì)性疾病如 炎癥性疾病IBD和功能性疾病如IBS。這種體外診斷工具可以避免昂貴的費(fèi)用和結(jié)腸鏡侵入 性的檢查。2005年3月14-17日在伯明翰召開的英國腸胃病學(xué)學(xué)會(BSG)年會，專題討論了炎 癥性腸病(IBD)-鈣衛(wèi)蛋白-腸激惹綜合征(IBS)，將鈣衛(wèi)蛋白作為一個新的有用的診斷參考 標(biāo)志，用于：區(qū)別炎性腸病和腸激惹綜合征；評估炎性腸病炎性活動性；評估炎性腸病黏膜 治愈情況。

糞便的鈣衛(wèi)蛋白的檢測是一種簡單、迅速的、靈敏度高、特異性強(qiáng)、廉價的、非侵襲 性的炎性腸病檢測方法。這種檢測方法可以在正常人的黏膜和患病患者的炎性黏膜中都可 獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析表明每150ug/g的截?cái)帱c(diǎn)就可以 區(qū)別炎性腸病(inflammatoryboweldisease,IBD)和腸應(yīng)激綜合征(irritablebowel syndrome,IBS)患者,它的敏感性為100％,特異性達(dá)到了97％。

對于鈣衛(wèi)蛋白的檢測，目前臨床的方法包括：酶聯(lián)免疫法(ELISA)、膠體金法等方 法，但這些方法都有各自的特點(diǎn)及不足。ELISA法由于定量準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于醫(yī)院檢驗(yàn)科，但 檢測時間長，不便捷；膠體金法雖然方便、快捷，但是是一種定性方法，其靈敏度較低；膠體 金顆粒與抗體連接方式屬于靜電吸附，檢測過程中脫落可造成結(jié)果不準(zhǔn)確、不穩(wěn)定。

因此，臨床上迫切需求建立一種快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的鈣衛(wèi)蛋白定量檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于定量檢測鈣衛(wèi)蛋白的免疫層析試紙條，其 具有成本低廉，測定便捷的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測鈣衛(wèi)蛋白的免疫層析試紙條的制備方法。

本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測鈣衛(wèi)蛋白的免疫層析試紙條的應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明提供一種用于定量檢測鈣衛(wèi)蛋白的試紙條，所述的試紙條包括底 板，所述的底板上附著有沿縱向依次排列的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。

進(jìn)一步的，所述的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊在所述的底板上從左 到右依次排列，所述的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊的長度比為13-17:10-12: 20-24:24-24。

進(jìn)一步的，所述的標(biāo)記抗體墊包括包被有標(biāo)記物的第一鈣衛(wèi)蛋白單克隆抗體。

進(jìn)一步的，所述的標(biāo)記物標(biāo)記的第一鈣衛(wèi)蛋白單克隆抗體是熒光標(biāo)記的鈣衛(wèi)蛋白 抗體。

進(jìn)一步的，所述的包被膜上包被有檢測帶和質(zhì)控帶，所述檢測帶固定有第二鈣衛(wèi) 蛋白單克隆抗體，所述的質(zhì)控線上固定有兔抗鼠IgG抗體。

進(jìn)一步的，所述的包被膜為硝酸纖維素膜。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于定量檢測鈣衛(wèi)蛋白的試紙條的制備方法，包括如 下步驟：在試紙條的底板上依次固定樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。

進(jìn)一步的，所述的包被膜通過如下方法制備而得：

使用第一磷酸鹽緩沖液分別稀釋兔抗小鼠IgG和鈣衛(wèi)蛋白抗體得到兔抗小鼠IgG 溶液和鈣衛(wèi)蛋白抗體溶液，所述的第一磷酸鹽緩沖液濃度為0.01-0.03M，pH值為7.2-7.6， 所述的兔抗小鼠IgG溶液和鈣衛(wèi)蛋白抗體溶液的濃度均為1mg/ml-1.5mg/ml；使用定量噴膜 儀以0.8-1.2μl/cm的量將二者以0.5cm-1.0cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35-38℃烘干 0.5-1.5h，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?

進(jìn)一步的，所述的標(biāo)記抗體墊由如下方法制備而得：

制備鈣衛(wèi)蛋白抗體溶液：用第一硼酸鹽緩沖液將鈣衛(wèi)蛋白抗體透析得到鈣衛(wèi)蛋白 抗體溶液，所述的第一硼酸鹽緩沖液濃度為0.03-0.07M，pH值為8.0-8.5，透析溫度為3-5 ℃，透析時間T≥16h；將所述的鈣衛(wèi)蛋白抗體溶液濃度調(diào)整為1.5-2mg/ml；