[發(fā)明專利]高效豬組成型啟動(dòng)子及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610192603.5
• 申請(qǐng)日: 2016-03-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105779455B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段子淵;侯凱麗;王小琪;張瑞瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發(fā)明涉及高效豬組成型啟動(dòng)子及應(yīng)用。本發(fā)明提供的豬組成型啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子來(lái)自豬TMSB10基因的?1893bp～184bp區(qū)，其序列選自如SEQ ID NO:1?7所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供豬雜合啟動(dòng)子，其是將所述豬組成型啟動(dòng)子與hCMV增強(qiáng)子融合獲得的啟動(dòng)子。本發(fā)明首次從豬中克隆獲得高效組成型啟動(dòng)子，并成功構(gòu)建出含有hCMV增強(qiáng)子序列的豬雜合啟動(dòng)子，并對(duì)啟動(dòng)子的活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，豬雜合啟動(dòng)子的活性約為hCMV啟動(dòng)子活性的1.5倍。本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于豬TMSB10基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究，并用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行相關(guān)蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種高效豬組成型啟動(dòng)子及應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬肉為人類提供優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，優(yōu)良豬種的培育對(duì)于推動(dòng)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要作用。同時(shí)，由于豬在解剖學(xué)，生理學(xué)和遺傳學(xué)等方面與人類具有高度相似性，因而被認(rèn)為是人類異種器官移植的理想供源和人類疾病研究的模式動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以通過(guò)基因工程等技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)對(duì)豬的基因組進(jìn)行上述有目的的可遺傳修飾。

啟動(dòng)子是一段脫氧核糖核酸序列，是基因的重要組成部分，能通過(guò)與反式作用因子相互作用來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)間和轉(zhuǎn)錄程度。真核生物啟動(dòng)子根據(jù)發(fā)揮作用的時(shí)間和空間特異性可分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能夠在不同組織和不同細(xì)胞中啟動(dòng)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。鑒于啟動(dòng)子啟動(dòng)活性對(duì)于目的基因表達(dá)水平的這種重要的調(diào)控作用，具有高效并持續(xù)穩(wěn)定啟動(dòng)目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子往往是科研工作者在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作時(shí)的首選。

目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的啟動(dòng)子包括hCMV、EEF1α、PGK、CAG等，這些啟動(dòng)子雖然在體外都能很好啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，但都不是宿主來(lái)源的啟動(dòng)子，在整合到豬的基因組中之后可能會(huì)引發(fā)宿主細(xì)胞防御機(jī)制而失活。因此，高效豬組成型啟動(dòng)子的克隆有著重要的意義。

另外，已有相關(guān)報(bào)道證明，hCMV增強(qiáng)子可有效增強(qiáng)真核啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，小鼠活體實(shí)驗(yàn)中雜合啟動(dòng)子仍能夠發(fā)揮良好的功能。

目前，尚未有從豬中克隆高效組成型啟動(dòng)子及應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供新型豬高效組成型啟動(dòng)子及豬雜合啟動(dòng)子。

本發(fā)明的另一目的是提供上述啟動(dòng)子的應(yīng)用。

本發(fā)明基于以下構(gòu)思：利用Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找豬胸腺素β-10基因(TMSB10)的5’上游調(diào)控序列，利用在線真核啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件NNPP、TSSW、Promoter 2.0、Promoter Scan、FirstEF對(duì)該基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域順?lè)词阶饔迷癈pG島分布情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。設(shè)計(jì)一系列引物，從馬身豬的基因組中PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)目的片段，并將目的片段插入報(bào)告載體pGL3-basic中構(gòu)建重組載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用β-gal作為參照物檢測(cè)不同啟動(dòng)子片段的活性。最后在活性和長(zhǎng)度都合適的片段前插入了hCMV增強(qiáng)子序列，采用相同的方法對(duì)雜合啟動(dòng)子的活性進(jìn)行了分析，并驗(yàn)證了不同啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的豬組成型啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子來(lái)自豬TMSB10基因的-1893bp～184bp區(qū)，其序列選自如SEQ ID NO:1-7所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供豬雜合啟動(dòng)子，其是將所述豬組成型啟動(dòng)子與hCMV增強(qiáng)子融合獲得的啟動(dòng)子。優(yōu)選是將如SEQ ID NO:5所示的豬組成型啟動(dòng)子與如SEQ ID NO:8所示的hCMV增強(qiáng)子融合獲得的啟動(dòng)子。

更優(yōu)選地，所述豬雜合啟動(dòng)子為PhCMVE-TMSB10，其序列為：

i)SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或