[發明專利]一種禽網狀內皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復合物及其制備方法

有效

• 申請號: 201610191956.3
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN105664151B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 郭慧君;袁霏;李宏梅
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: A61K39/21
• 分類號: A61K39/21;A61K39/39;A61P31/14
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本發明涉及生物免疫領域，提供了一種禽網狀內皮增生癥病毒(REV)亞單位疫苗注射復合物及其制備方法，包括禽網狀內皮增生病毒(REV)亞單位疫苗抗原和對應的免疫佐劑，獲得上述抗原后與佐劑聯合免疫接種，其中亞單位疫苗的制備是根據REV囊膜蛋白gp90基因設計的引物擴增后得到目的基因，經大腸桿菌等表達制備重組蛋白獲得疫苗抗原，該重組抗原與硫代化核酸緩釋佐劑乳化混勻后，對禽鳥進行免疫接種，能夠有效地預防或治療禽鳥REV的感染，具有很好的商品化開發前景。

技術領域

本發明涉及生物免疫領域，提供了一種禽網狀內皮增生癥病毒(REV)亞單位疫苗注射復合物及其制備方法。

背景技術

網狀內皮增生病毒(REV)是一種可引起感染雞免疫抑制和網狀內皮組織增生為主的單股RNA病毒，與人艾滋病毒(HIV)同屬；在我國及雞飼養量較大的國家和地區呈現規模較大的流行，我國近三年廣西、安徽、江西等地流行病學調查表明，REV感染率均在30％以上，僅次于馬立克氏病，呈現以二重或多重感染為主的流行趨勢，每年給我國養禽業帶來嚴重的經濟損失。該病毒在雞群中可垂直傳播和水平傳播，自然狀態下以前者為主，橫向傳播多發生于免疫力低下的雛雞或昆蟲叮咬以及污染的疫苗接種傳播；病毒雖為RNA病毒，但在免疫選擇壓下不易發生變異，但易與其它DNA病毒發生重組而改變自身特性。自然感染狀態下，REV引起感染雞產生腫瘤的比例并不高，而引發機體對疫苗反應的降低、淋巴細胞轉化能力下降等免疫抑制最為多見，從而造成對其他病原的易感性增強。目前尚無有效的藥物和市場化的疫苗來防治該病。

崔治中曾報道使用致弱毒株感染種雞誘導產生母源抗體阻斷雛雞的早期感染的方法；最近報道使用桿狀病毒表達系統和畢赤酵母表達系統以及真核表達質粒pCAGGS對REV囊膜基因gp90進行誘導表達獲得具有一定免疫保護原性的重組蛋白，但以上方法都有一定局限性，前者致弱的病毒免疫原具有返強和復壯的危險，后者誘導所產生的抗體效價仍舊偏低，仍不能產生足夠的保護力，另外研制過程復雜、技術性強、獲得表達產物少、成本高等缺點也限制了該方法的臨床應用。

使用原核表達系統制備結構簡單的重組蛋白仍是目前生產亞單位疫苗或免疫原的主要方法，具有操作相對簡單、表達產物量大、易于純化、成本低等優點，但免疫原性相對較低，人們往往使用免疫佐劑提高原核表達產物的免疫原性。傳統免疫佐劑是油乳佐劑，能夠提高滅活疫苗和蛋白抗原等的免疫原性和免疫保護能力，但與弱毒苗相比，仍存在很大的差距，往往達不到生產臨床中需要的防治效果。因此如何獲得一種高效的禽網狀內皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復合物成為亟待解決的問題之一。

發明內容

針對現有技術中存在的缺失，本發明提供了一種禽網狀內皮增生癥病毒(REV)亞單位疫苗注射復合物及其制備方法，包括禽網狀內皮增生病毒(REV)亞單位疫苗抗原和對應的免疫佐劑，獲得上述抗原后與佐劑聯合免疫接種，其中亞單位疫苗的制備是根據REV囊膜蛋白gp90基因設計的引物擴增后得到目的基因，經大腸桿菌等表達制備重組蛋白獲得疫苗抗原，該重組抗原與硫代化核酸緩釋佐劑乳化混勻后，對禽鳥進行免疫接種，能夠有效地預防或治療禽鳥REV的感染，具有很好的商品化開發前景。

本發明的具體技術方案如下：

一種禽網狀內皮增生癥病毒亞單位疫苗注射復合物，包括禽網狀內皮增生病毒亞單位疫苗抗原和核酸緩釋佐劑，

其中所述的禽網狀內皮增生病毒亞單位疫苗抗原為gp90蛋白抗原，其制備方法是通過設計的特異性引物：

上游引物：5-CCGGAATTCTCCTCCATACCTACCTATTACA-3'其核苷酸序列如Seq ID No:1所示；

下游引物：5-AGAGTCGACTCAATTAGGGAGTGCCGTGT-3其核苷酸序列如Seq ID No:2所示；

擴增REV囊膜蛋白gp90的基因，構建包含gp90基因的原核表達質粒重組質粒REV-gp90-pET32a，經誘導表達純化后獲得；