[發明專利]一種牛磺熊去氧膽酸的制備方法

在審

• 申請號: 201610191921.X
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN107287272A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 趙淑娟;王崢濤;楊莉;史杰;周吉燕;胡之璧;張金家
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P33/00;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及一種?；切苋パ跄懰岬闹苽浞椒?，具體說，是涉及一種通過遺傳改造的非致病性微生物進行的將?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)原位轉化為?；切苋パ跄懰?TUDCA)的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

以外源性的天然或合成的有機化合物為底物，添加至處于生長狀態的生物體系或酶體系中，在適宜的條件下進行培養，使得底物與生物體系中的酶發生相互作用，從而產生結構改變，這一過程稱為生物轉化。生物轉化以多種不同催化功能的酶體系對中藥化學成分進行轉化，可以產生新的天然化合物，或提高中藥有效成分的水溶性，降低化合物的毒性，再通過與藥理篩選手段相結合，可從中找到新的高活性或低毒性的天然活性先導化合物。

?；切苋パ跄懰?TUDCA)，是熊膽中的主要膽汁酸，具有解痙、抗驚厥、抗炎及溶解膽石等作用。2007年以商品名滔羅特(Taurolite)獲準在中國銷售，臨床主要用于治療膽囊膽固醇結石、原發硬化性膽管炎、原發膽汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等常見疾病，且得到較好的療效。TUDCA與?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)結構上是7位羥基的差向異構，二者的化學結構式如下：

目前，除了采用“活熊引流取膽”法得到?；切苋パ跄懰幔€可以通過化學合成法來制備?！盎钚芤魅∧憽眰涫軤幾h，化學合成法也因步驟繁瑣，或成本高，或收率低，且要使用大量有機溶劑，不利于分離純化得到無毒害的下游產物。因此，應用中藥生物技術將TUDCA在生物工程菌中高效表達，實現大規模工業化發酵生產是解決問題的有效途徑。另一方面，對降低獲取TUDCA的成本，簡化獲取步驟，提高TUDCA的質量也具有重要意義。

TCDCA是一種廣泛存在于雞、鴨、鵝等禽畜膽汁中的膽酸類化合物，利用TCDCA作為原料，直接以遺傳改造的大腸桿菌作為轉化菌株，制備TUDCA的方法至今尚未見到有關報道，且可以實現資源合理利用。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于采用基因工程方法遺傳改造大腸桿菌，并通過微生物發酵，將?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)原位轉化為?；切苋パ跄懰?TUDCA)的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種?；切苋パ跄懰岬闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟冢簽楣こ叹苯影l酵轉化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密碼子優化、工程菌的構建、工程菌培養、底物的轉化及產物制備。所述工程菌為同時表達7α-HSDH和7β-HSDH基因的大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物為牛磺鵝去氧膽酸。

7α-HSDH和7β-HSDH分別為7α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥基類固醇脫氫酶；

兩個7α-HSDH分別來源于:撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599,GenBank登錄號：JN191345.1)和大腸桿菌(Escherichia coli strain TW14359,GenBank登錄號：CU928163.2)，

兩個7β-HSDH基因分別來源于:撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599,GenBank登錄號：JN191345.1)和活潑瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strain N53,GenBank登錄號：KF052988.1)，

分別采用http://www.jcat.de/在線軟件以大腸桿菌為宿主菌，根據密碼子偏好性，對全基因序列進行密碼子優化，并進行全基因合成，分別記為α1、α2、β1、β2。

所述的由?；蛆Z去氧膽酸獲取?；切苋パ跄懰岬暮啽惴椒?，其特征在于，包括如下具體步驟：

a)雙基因表達載體的構建

①兩個7α-HSDH和兩個7β-HSDH的編碼區(ORF)分別進行密碼子優化，5’和3’段增加酶切位點，并進行全基因合成，分別記為α₁、α₂、β₁、β₂；