[發(fā)明專利]一種牛磺熊去氧膽酸的制備方法

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• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN107287272A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙淑娟;王崢濤;楊莉;史杰;周吉燕;胡之璧;張金家
• 申請（專利權(quán)）人: 上海中醫(yī)藥大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P33/00;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種牛磺熊去氧膽酸的制備方法，其特征在于：

工程菌直接發(fā)酵轉(zhuǎn)化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密碼子優(yōu)化、工程菌的構(gòu)建、工程菌培養(yǎng)、底物的轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物制備；所述工程菌為同時表達7α-HSDH和7β-HSDH基因的大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物為牛磺鵝去氧膽酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種牛磺熊去氧膽酸的制備方法，其特征在于：

7α-HSDH和7β-HSDH分別為7α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥基類固醇脫氫酶；

兩個7α-HSDH分別來源于:撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599，GenBank登錄號：JN191345.1)和大腸桿菌(Escherichia coli strain TW14359，GenBank登錄號：CU928163.2)，

兩個7β-HSDH基因分別來源于:撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599，GenBank登錄號：JN191345.1)和活潑瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strain N53，GenBank登錄號：KF052988.1)，

分別采用http://www.jcat.de/在線軟件以大腸桿菌為宿主菌，根據(jù)密碼子偏好性，對全基因序列進行密碼子優(yōu)化，并進行全基因合成，分別記為α1、α2、β1、β2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種牛磺熊去氧膽酸的制備方法，其特征在于：，包括如下具體步驟：

a)雙基因表達載體構(gòu)建

①兩個7α-HSDH和兩個7β-HSDH分別進行密碼子優(yōu)化，并進行全基因合成，分別記為α₁、α₂、β₁、β₂；

②合成的四個基因各自雙酶切并分別連接入pETM6載體，得pETM6-α₁、pETM6-α₂、pETM6-β₁、pETM6-β₂；

③將pETM6-α₁、pETM6-α₂、pETM6-β₁、pETM6-β₂分別進行酶切連接，得到pETM6-α₁β₁、pETM6-α₁β₂、pETM6-α₂β₁、pETM6-α₂β₂。

b)多基因表達載體構(gòu)建

在pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重組載體的基礎(chǔ)上，分別酶切重組載體和pETM6-β1、pETM6-β2，再次連接β基因，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2；

c)工程菌的構(gòu)建

①將pETM6-α₁β₁、pETM6-α₁β₂、pETM6-α₂β₁、pETM6-α₂β₂分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21star感受態(tài)細胞，得到四個帶有雙基因表達載體的工程菌

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₂；

pETM6空載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到E.coli BL21star-pETM6，作為載體對照工程菌；

②將pETM6-α₁β₁β₁、pETM6-α₁β₁β₂、pETM6-α₁β₂β₂、pETM6-α₂β₁β₁、pETM6-α₂β₁β₂、pETM6-α₂β₂β₂分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21star感受態(tài)細胞，得到六個帶有多基因表達載體的工程菌

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₁β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₂β₂；

d)工程菌的培養(yǎng)

①將工程菌接種到LB固體平板培養(yǎng)基中活化，于20～40℃活化培養(yǎng)1～7天；

②從LB固體平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于加有附加50～100mg/L氨芐青霉素(Amp⁺)LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在75～225rpm/min、20～40℃下震蕩培養(yǎng)12～24小時；

③將上述培養(yǎng)物按1:50比例接種到液體M9培養(yǎng)基，在75～225rpm/min、20～40℃下震蕩培養(yǎng)3～5小時，加入0.1～1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)3～5小時；

e)底物發(fā)酵轉(zhuǎn)化

①將上述培養(yǎng)物離心，收集菌體，以5～20倍濃縮至新的附加50～100mg/L的Amp+、0.1～1mM的IPTG的M9培養(yǎng)基；

②添加底物，于75～225rpm/min、20～40℃下震蕩培養(yǎng)1～3天，進行底物的發(fā)酵轉(zhuǎn)化；

f)牛磺熊去氧膽酸制備

①發(fā)酵過程結(jié)束，收集轉(zhuǎn)化液，用等體積的正丁醇分三次反復萃取，合并萃取液，減壓濃縮揮干正丁醇；

②所得殘渣用乙醇溶解后，再次減壓濃縮揮干，所得干燥物即為以牛磺熊去氧膽酸為主要成分的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；

③取部分干燥物用甲醇水溶解，0.22μm濾膜過濾，用XBridgeTM C18 5μm色譜柱，對轉(zhuǎn)化后成分進行分析。