[發明專利]一種酵母表達的雞Cathelicidin1抗菌肽及其制備方法與應用在審
| 申請號： | 201610191730.3 | 申請日： | 2016-03-30 |
| 公開（公告）號： | CN105732792A | 公開（公告）日： | 2016-07-06 |
| 發明（設計）人： | 黃兵;馬秀麗;于可響;劉存霞;吳靜;史玉穎;胡峰;李玉峰;宋敏訓 | 申請（專利權）人： | 山東省農業科學院家禽研究所（山東省無特定病原雞研究中心） |
| 主分類號： | C07K14/465 | 分類號： | C07K14/465;C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;A61K38/17;A61P31/04;C12R1/84 |
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| 地址： | 250023 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 酵母 表達 cathelicidin1 抗菌 及其 制備 方法 應用 | ||
1.一種重組雞Cathelicidin1抗菌肽，其特征在于：其成熟肽包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權利要求1所述的重組雞Cathelicidin1抗菌肽的基因，其特征在于：其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
3.一種含有權利要求2所述重組雞Cathelicidin1抗菌肽基因的表達載體。
4.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為重組質粒pPICZαA-CathL1。
5.一種含有權利要求3或4所述的表達載體的重組菌，其特征在于：所述的重組菌為生產雞Cathelicidin1抗菌肽的畢氏酵母工程菌。
6.根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為分泌型重組酵母表達菌株X-33/pPICZαA-CathL1。
7.一種構建權利要求5或6所述重組菌的方法，其特征在于：將權利要求3或4所述的表達載體導入畢氏酵母宿主菌株，以使所述表達載體在所述宿主中有效表達。
8.根據權利要求7所述的構建所述重組菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)以成年烏骨雞骨髓RNA為模板，擴增其Cathelicidin1成熟肽的編碼序列，克隆至pMD18-T載體中，篩選陽性克隆并測序驗證；
(2)將Cathelicidin1成熟肽的編碼序列與分泌型酵母表達載體pPICZαA相連接，篩選陽性克隆，并大量制備陽性質粒pPICZαA-CathL1；
(3)將pPICZαA-CathL1重組質粒經酶切線性化后利用電穿孔導入PichiapastorisX-33宿主細胞基因組中，獲得分泌型重組酵母表達菌株X-33/pPICZαA-CathL1；并將轉化子經甲醇利用表型的MM/MD平板篩選，得到能夠正常利用甲醇的重組酵母菌株。
9.一種權利要求1所述重組雞Cathelicidin1抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)按照權利要求7或8所述方法構建所述重組菌；
(2)用蝸牛酶提取法制備所述重組菌的DNA模板，采用PCR方法篩選陽性轉化子；
(3)將篩選到的陽性酵母菌株進行甲醇誘導表達，并對誘導表達條件進行優化；
(4)取不同時間段內的表達上清液，利用DOC-TCA蛋白濃縮方法處理上清，獲得重組蛋白，即得。
10.權利要求1所述重組雞Cathelicidin1抗菌肽用于制備治療革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌感染引起疾病的藥物中的應用。
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