[發明專利]一種重組豬源抗菌肽及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610177901.7
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105622744A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 單安山;王玨
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/75;A61K38/17;A61P31/04
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司 23101
• 代理人: 吳振剛

技術領域

本項發明屬于農業畜牧獸醫應用領域，涉及的是一種重組豬源抗菌肽及其制備方 法和應用。

背景技術

隨著抗生素在飼料生產以及動物養殖中的不斷應用，許多問題接踵而至，如抗生 素添加劑的長期使用導致耐藥性病原菌的產生，耐藥菌株的出現不僅威脅到了畜牧業，更 成為了人類不得不面對的公共衛生危機。因此，人們迫切需要開發一種新型安全的抗菌物 質作為飼料添加劑替代抗生素添加到飼料中，從而達到預防動物疾病，促進動物生長，降低 飼養成本目的。重組肽PR39是重組表達的一種豬源抗菌肽，含有39個氨基酸殘基。它不僅是 一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，與此同時還具有許多生物活性例如促進傷口愈合、 促進血管生成和降低炎癥反應等作用。本研究利用基因工程方法在枯草芽胞桿菌中成功表 達了具有廣譜抗菌活性的重組抗菌肽PR39，為基因工程方法規模化生產抗菌肽奠定了理論 與實踐基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種豬源抗菌肽及其制備方法和應用，是一種具有廣譜抗 菌活性的重組肽。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種重組豬源抗菌肽PR39，其序列如序列 表SeqNo.1所示。

本發明還具有如下技術特征：

1、如上所述的一種重組豬源抗菌肽PR39的制備方法，如下：根據枯草芽孢桿菌的 分泌特點以及下游純化技術特點，在豬源抗菌肽PR39基因上游融合信號肽AmyQ基因，六個 組氨酸基因，硫氧還蛋白基因以及腸激酶切位點基因，并在整條基因兩端添加酶切位點 EcoRⅠ和BamHⅠ。

2、如上所述的一種重組豬源抗菌肽PR39，在治療革蘭氏陰性菌感染性疾病藥物中 的應用。

本發明的重組肽PR39是一種重組表達的豬源抗菌肽，它是一種具有廣譜抗菌活性 的小分子多肽，同時還具有許多生物活性例如促進傷口愈合、促進血管生成和降低炎癥反 應等作用。其制備方法為基因工程方法規模化生產抗菌肽奠定了理論與實踐基礎，對建立 肽類基因工程菌和抗菌肽研究的共性技術具有重要意義。

附圖說明

圖1為目的基因片段酶切鑒定結果圖，

其中，M：DNA分子量標準；1：空載體質粒；2：重組表達載體質粒；3：重組表達載體 EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切結果；4：空載體EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切結果。

圖2為重組表達載體構建測序結果圖。

圖3為利用Tricine-SDS-PAGE對腸激酶切割融合蛋白的檢測結果圖，

其中，M：蛋白分子量Marker；1：未切割的融合蛋白；2：切割后的融合蛋白。

圖4為利用Tricine-SDS-PAGE純化后的PR39的檢測結果圖，

其中，M：蛋白分子量Marker；1和2均為利用陽離子交換柱純化后的肽。

圖5為重組抗菌肽PR39的溶血活性分析圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。

實施例1目的基因的設計與合成

根據枯草芽孢桿菌的分泌特點以及下游純化技術特點，在豬源抗菌肽PR39基因上 游融合信號肽AmyQ基因、六個組氨酸基因、硫氧還蛋白基因以及腸激酶酶切位點基因。具體 基因如下所示：

GCGGAATTCatgatccaaaaacgtaaacgtacagtttctttccgtcttgttcttatgtgcacacttcttttcgtttctcttcctatcacaaaaacatctgctcgtcgtcgtcctcgtcctccttaccttcctcgtcctcgtcctcctcctttcttccctcctcgtcttcctcctcgtatccctcctggcttccctcctcgtttccctcctcgtttccctGGATCC

其中，下劃線為限制性內切酶切位點，斜體為腸激酶酶切位點，虛線是組氨酸標 簽，雙下劃線為硫氧還蛋白編碼基因，加粗大寫為終止密碼子TAA。

上述整條融合基因AmyQ-6×His-Thioredoxin-Enterokinasesite-PR39由上海 生工生物技術有限公司合成。