[發明專利]一種攜帶多位點突變型EGFR新抗原基因的重組腺相關病毒載體及構建方法和應用

有效

• 申請號: 201610177879.6
• 申請日: 2016-03-24
• 公開（公告）號: CN105779480B
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: 申重陽;陳勇軍;王仲
• 申請（專利權）人: 成都康景生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/864;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 李蕊

本發明提供一種攜帶多位點突變型EGFR新抗原基因的重組腺相關病毒載體，其構建方法是將野生型EGFR基因酶連到重組腺相關病毒載體中，然后再將EGFR基因中R108K，A289V，S492R，G598V，G719S，S768I，T790M，C797S和L858R位點的堿基進行突變得到重組載體。本發明制備的重組腺相關病毒AAV6具有安全性高、侵染能力強的特點，尤其對于DC細胞具有很好的嗜性；本發明的靶向多位點突變型EGFR新抗原的AAV6?DC?CTL細胞免疫治療方法能有效殺傷EGFR新抗原陽性的腫瘤細胞，并靶向多種突變類型EGFR抗原的腫瘤患者，適用范圍廣且副作用很小。

技術領域

本發明屬于重組腺相關病毒載體的構建方法技術領域，具體涉及一種攜帶多位點突變型EGFR新抗原基因的重組腺相關病毒載體及構建方法和該載體在抗腫瘤細胞免疫治療領域的應用。

背景技術

腫瘤細胞具有無限的增殖能力，其原因在于失控的生長因子信號刺激或異常的生長因子受體表達。表皮細胞生長因子受體(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是一個跨膜蛋白，其胞內結構域屬于酪氨酸激酶成員；當EGFR與其配體表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor，EGF)結合后，可激活RAS-RAF-MAPK，PI3K-AKT和PLCγ信號轉導途徑，從而啟動促有絲分裂信號級聯反應。EGF/EGFR信號通路的異常激活還會導致腫瘤血管新生和腫瘤轉移。研究表明，大多數的上皮細胞腫瘤都表現為EGF/EGFR信號通路的失控，例如大約40-80％的非小細胞肺癌、80-100％的膠質細胞瘤、25-77％的結腸癌中都過表達EGFR；并且EGFR的表達量還與腫瘤的不良預后密切相關。因此，EGFR是一個重要的腫瘤治療靶點。

目前靶向EGFR的腫瘤治療藥物主要包括兩大類：anti-EGFR的單克隆抗體和抑制EGFR激酶活性的小分子。單克隆抗體藥物(如Cetuximab和Panitumumab)通過與失活態EGFR的胞外結構域結合，從而封閉其與配體EGF的結合位點，阻止配體誘導的EGFR酪氨酸激酶活性。而小分子藥物(如Erlotinib和Gefitinib)的作用機制在于它們能競爭性地與EGFR的胞內激酶催化結構域結合，從而抑制EGFR的自磷酸化和下游信號轉導?，F在已有數十種靶向EGFR 的藥物已經研發出來，在臨床試驗中表現出了良好的療效。其中單克隆抗體類藥物Cetuximab和Panitumumab，小分子藥物Erlotinib和Gefitinib已經成功上市用于治療轉移性非小細胞肺癌、結腸癌、頭頸部鱗癌和胰腺癌，但是隨著臨床使用越來越多其耐藥性的問題也隨之產生。

隨著研究的深入，EGFR靶向治療耐藥性的發生機制逐漸被闡釋清楚。臨床治療中EGFR抑制劑抵抗的產生主要由內在的和獲得性的因素所導致。內在的因素主要包括EGFR基因的拷貝數、EGFR蛋白的表達量、PI3K/AKT信號通路的異常、K-RAS基因的突變以及EGFR基因的突變。研究發現，Cetuximab對于攜帶野生型K-RAS基因的轉移性結腸癌是有效的，而對于攜帶突變型K-RAS基因的腫瘤是無效的。PIK3CA基因的突變引起AKT信號轉導激活，并導致轉移性結腸癌患者對于Panitumumab或Cetuximab靶向治療產生耐藥性。EGFR基因的突變情況與EGFR抑制劑的敏感性密切相關。EGFR基因點突變L858R讓非小細胞肺癌細胞對于Gefitinib具有更高的敏感性，而獲得性突變T790M則導致患者產生耐藥性。目前針對T790M突變導致的耐藥性問題，人們又研發了第二代、第三代EGFR抑制劑(如Afatinib、AZD9291、Rociletinib等)，并在臨床試驗中取得了一定的療效。然而第三代EGFR抑制劑也面臨著新的問題。12例攜帶T790M的肺癌患者經Rociletinib治療后，一部分患者的T790轉變為野生型并產生耐藥性。AZD9291會引發EGFR基因的另一個獲得性突變C797S，對于攜帶C797S突變型EGFR的患者來說目前尚無有效性藥物。因此，EGFR基因的點突變尤其是獲得性突變是EGFR靶向治療耐藥性發生的主要原因之一，而耐藥性是制約靶向治療效果的關鍵。