[發明專利]甲胎蛋白核酸適體AFP4及其制備方法

在審

• 申請號: 201610176305.7
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105647933A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 徐大鵬
• 申請（專利權）人: 徐大鵬
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 黃南概

技術領域

本發明屬于球蛋白檢測技術領域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和 力的甲胎蛋白核酸適體及其制備方法。

背景技術

甲胎蛋白（AFP）是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，胎 兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在產婦羊水或母體血漿中AFP可用于胎兒產前監測。如在神經管缺損、脊柱 裂、無腦兒等時，AFP可由開放的神經管進入羊水而導致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在 宮腔內死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經羊水部分進入母體血循環。 在85%脊柱裂及無腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見升高而有診斷價值，但必須與臨 床經驗結合，以免出現假陽性的錯誤。

檢測甲胎蛋白的方法有好幾種，放射免疫法測得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持續4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持續8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌癥后，需再結合定位檢 查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出診斷。不過，正常懷孕的婦女、少數肝 炎和肝硬化、生殖腺惡性腫瘤等情況下甲胎蛋白也會升高，但升高的幅度不如肝癌那樣高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白濃度多在25～200微克/升之間，一般在2個月內隨病情的好轉而 下降，多數不會超過2個月；同時伴有轉氨酶升高，當轉氨酶下降后甲胎蛋白也隨之下降，血 清甲胎蛋白濃度常與轉氨酶呈平行關系。如果甲胎蛋白濃度在500微克/升以上，雖有轉 氨酶升高，但肝癌的可能性大，轉氨酶下降或穩定，而甲胎蛋白上升，也應高度懷疑肝癌。目 前甲胎蛋白的檢測方法有三大類：色譜法、免疫學法、循環酶法。色譜法靈敏度高、特異性 好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標準化；而且HPLC設備價格昂 貴、技術條件要求高，需專門的維護人員，使其推廣困難。免疫學法需要還原游離AFP形式， 抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測游離型同型半胱胺酸，只能檢測血漿總同型半胱胺 酸，用還原劑在37℃半小時卵育對血樣進行還原處理。免疫學法需一小時以上才能出結果， 操作步驟繁瑣，因為需要進行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環酶法過程繁瑣，且 檢測限低、產生誤差較大，價格昂貴，故得不到推廣。

核酸適配體是近年發展起來的一類新型識別分子，近年來受到科學家的廣泛關 注，大量針對重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方 法和技術已被報道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準上市。SELEX技 術篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子,國內其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識 體或核酸適配體等。SELEX技術是指應用化學法合成大容量的隨機寡核苷酸(由兩端的固 定序列和中間的隨機序列組成)文庫,通過施加選擇壓力(結合靶目標，淘選與靶目標高度 特異結合片段的過程),并結合體外擴增技術,經過多輪的循環選擇富集,獲得與靶物質 高度特異結合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長度一般為25~60個核苷酸。

由上可知，核酸適體與靶物質結合所呈現的高敏感性和高特異性,使其在疾病診 斷中具有良好的應用前景,盡管目前成熟的臨床應用報道較少,但應用適體檢測球蛋白 的研究卻不斷增多,基于適體的檢測新技術也不斷出現。但是目前基于核酸適體的針對于 甲胎蛋白的高效特異性識別研究還很缺乏，且針對于甲胎蛋白的核酸適體及其篩選制備方 法尚未見有報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有的甲胎蛋白檢測技術的不足，填補還未見甲 胎蛋白的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種甲胎蛋白核酸適體及其制備方法，本 發明所提供的核酸適體命名AFP4。

本發明的方案是通過這樣實現的：一種甲胎蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸 適體的核苷酸序列其序列為：ggatgcggtaacggtacgtacctgtatagtgtgacatcct gtctccaaccacctgctgacgtgc。

以上所述甲胎蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種：

（1）將權利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化 嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；