[發明專利]一種凍存口腔干細胞可用性篩檢的方法

在審

• 申請號: 201610170264.0
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN107227294A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發明（設計）人: 張建國;周彥恒
• 申請（專利權）人: 北京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12Q1/02;C12Q1/68
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，尤其是涉及一種可有效提升干細胞健康使用概率的凍存口腔干細胞可用性篩檢的方法。

背景技術

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，具有增殖和分化潛能、以及自我更新復制的能力，能夠產生高度分化的功能細胞。近年來，干細胞在美容整形、器官移植、疾病治療、生物修復等領域開始得到快速應用和發展?？谇桓杉毎抢^造血干細胞、臍帶干細胞、脂肪干細胞之后有一個功能強大、應用領域廣泛的干細胞類型。

為了進一步提高口腔干細胞的應用安全及潛能發揮等性能，本案發明人提出了一種凍存口腔干細胞可用性篩檢的方法，以便將干細胞在凍存解凍復蘇后所存在的基因先天缺陷、染色體損傷等缺陷及時篩檢出來，進而確保干細胞在使用過程中的潛能健康發揮。

發明內容

本發明的目的在于提供一種凍存口腔干細胞可用性篩檢的方法，為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種凍存口腔干細胞可用性篩檢的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟S001、操作人員將手洗凈并用消毒水消毒，或者戴上消毒處理后的手套；

步驟S002、自液氮或干冰容器中取出潔凈的培養容器，并將由干細胞無血清基礎培養基、小分子肽、及螺旋藻混合所組成的新鮮培養基倒入該培養容器內；

步驟S003、將裝有上述步驟S002中所述新鮮培養基的所述培養容器快速置于37℃恒溫水槽中進行回溫；

步驟S004、將上述步驟S003中回溫后的所述培養容器用酒精含量達65％以上的酒精棉擦拭，擦拭后移入無菌操作臺內待用；

步驟S005、將凍存有口腔干細胞的冷凍保存管取出，并立即放入37℃恒溫水槽中快速解凍，且輕搖所述冷凍保存管使其內部的干細胞在1分鐘內全部融化；

步驟S006、將經上述步驟S005中解凍后的干細胞懸浮液加入含有上述步驟S002中所述新鮮培養基的離心管內，以1000rpm的轉速離心不低于3 分鐘，然后去除以DMSO或glycerol冷凍保護劑為主要成份的上清液；

步驟S007、將經上述步驟S006離心去除冷凍保護劑后的干細胞液緩緩加入經上述步驟S004處理后的所述培養容器內，并將干細胞液與所述新鮮培養基按照1:5～1:10的稀釋比進行均勻混合；

步驟S008、將上述步驟S007中裝有稀釋混合后干細胞液的所述培養容器放入培養箱中，對干細胞進行10小時以上的恢復性培養孵育；

步驟S009、用潔凈試管取出經過上述步驟S008培養孵育后的干細胞10μl，并將10μl臺盼藍活性染料緩緩加入所述潔凈試管內與10μl干細胞形成等比混合，輕輕搖晃所述潔凈試管使混合充分；

步驟S010、將上述步驟S009中干細胞與臺盼藍活性染料的混合溶液緩緩倒入潔凈的血球計數盤，蓋上玻片，用100倍顯微鏡觀察干細胞存活情況，沒有被臺盼藍活性染料染色的干細胞為活細胞，被臺盼藍活性染料染成藍色或紅色的干細胞為死細胞；

步驟S011、借助上述步驟S010中的顯微鏡，用吸附器具將上述步驟S010中所發現的死細胞吸出，實現初步篩選；

步驟S012、利用染色質免疫共沉淀基因測序分析技術，對經過上述步驟S011初步篩選后的活干細胞，進行PGS與PGD全基因篩查診斷，以篩檢干細胞的健康程度進而判斷可用性。

其中，

所述步驟S002中的所述小分子肽是由2～4個氨基酸所組成的活性小分子肽；

所述新鮮培養基中干細胞無血清基礎培養基、小分子肽、以及螺旋藻三者的組份比為9:0.35:0.65。

所述步驟S012還包括以下分步驟：

分步驟S01：利用植入前遺傳學篩查PGS對干細胞的染色體數目和染色體結構進行檢測，通過所述步驟S012中的染色質免疫共沉淀基因測序分析技術，分析檢測干細胞的染色體是否存在數目和結構上的缺陷、以及是否存在遺傳物質現象；

分步驟S02：利用植入前基因診斷PGD對干細胞中是否攜帶病變基因和遺傳缺陷基因進行檢測，通過所述步驟S012中的染色質免疫共沉淀基因測序分析技術，分析檢測干細胞的基因病變幾率。

本發明的有益效果是，通過將解凍后的干細胞放入帶有小分子肽成份的新鮮培養基中進行恢復性培養孵育，極大限度上提高了干細胞的復蘇率；然后通過臺盼藍活性染料將一部分已經死亡的干細胞進行初步篩選；最好再利用染色質免疫共沉淀基因測序分析技術，對干細胞進行PGS與PGD全基因篩查診斷，以得到干細胞的健康程度進而判斷其可用性。

附圖說明