[發明專利]肉鴨細小病毒精制卵黃抗體

在審

• 申請號: 201610164833.0
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105585632A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 魏思遠;趙光偉
• 申請（專利權）人: 重慶三杰眾鑫生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C07K16/02
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 高姜

技術領域

本發明涉及一種肉鴨細小病毒精制卵黃抗體，主要涉及抗體領域。

背景技術

2014年11月以來，我國部分地區肉鴨流行一種以臨床癥狀為鴨喙發育不良， 舌頭外露、腫脹、向下彎曲，發病率為10-30％，鴨發病日齡集中在2個階段， 第一階段為3～13日齡，癥狀為站立不穩，蹼外翻，強行驅趕時跛行或翻滾； 第二階段為21～28日齡，主要為運動障礙，跟不上大群，呈蹲坐式或側臥，并 表現出舌頭外露癥狀，患病鴨料肉比比正常鴨高30％以上，同日齡出欄體重比 正常鴨低20％以上，且發育不整齊，屠宰時易翅膀和腿骨折為特征的疾病。禽 病專家刁有祥等最先分離到病原，基因序列鑒定與鵝細小病毒同源性大于98％， 與番鴨細小病毒同源性為77％左右，命名為鴨細小病毒。常規治療方法基本無 效，對鴨養殖業造成巨大經濟損失。

發明內容

針對以上現有技術的不足，本發明提出一種的肉鴨細小病毒精制卵黃抗體。

為達到上述目的，本發明的技術方案是：

第一步，將分離得到的肉鴨細小病毒經易感鴨胚傳代12代獲得作為毒種， 然后將得到的肉鴨細小病毒用生理鹽水20000倍稀釋，經尿囊腔接種11日 齡易感鴨胚，0.1ml/胚，收集接種60～120小時死亡鴨胚尿囊液，無菌檢驗 合格后得到抗原；

第二步，抗原加終濃度為0.1％甲醛，37℃滅活24小時；于4℃經4000轉/ 分鐘離心30分鐘，收集上清液，上清液用超濾器濃縮15倍，濃縮液轉入 滅菌容器滅活檢驗合格后得到制備疫苗用抗原制備疫苗用抗原加入鴨白細 胞介素2，使鴨白細胞介素2終濃度為5μg/ml，即為鴨細小病毒白細胞介素 2佐劑滅活疫苗，無菌操作分裝，于2～8℃保存；

第三步，選取商品蛋雞進行抗原接種和收集高免雞蛋，對高免雞蛋進行消 毒、分離卵黃、抗體的萃取和過濾。

進一步，第一步中得到的抗原，要進行病毒含量、純凈性、特異性和免疫 原性進行鑒定。

進一步，抗原用生理鹽水10倍系列稀釋，取10^-5、10^-6和10^-73個稀釋度接 種9日齡易感鴨胚，每個稀釋度各接種5枚，每一胚胎0.1ml，用蠟封孔，于37.5℃ 靜置孵化，24小時以前死亡的鴨胚棄去不計，收集24～168小時死亡鴨胚，按 Reed-Muench法計算病毒含量為10^-6.25ELD₅₀/0.1ml。

進一步，免疫原性按如下進行免疫接種：

對100～110日齡商品蛋30只進行接種，同時設10只對照，不做任何處理， 免疫程序如下：

基礎免疫每只雞腿部肌肉注射1.0ml。

加強免疫在基礎免疫后21日進行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射 1.5ml。

強化免疫在加強免疫后15日進行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射 2.0ml。

進一步，選取100-120日齡蛋雞進行滅火抗原接種：維持免疫：當卵黃中鴨 細小病毒瓊擴抗體效價臨界1:32時，維持接種1次，每只雞頸背部皮下注射疫 苗2.0ml。強化免疫后7日，抽樣取蛋，分離卵黃，提取抗體，檢測鴨細小病毒 瓊擴抗體效價大于等于1:32為合格，收集高免雞蛋，8～12℃貯存，應不超過 10日。

進一步，充分攪拌使卵黃呈均勻膏狀，裝入滅菌攪拌罐中，按體積比1:3加 入25℃左右、pH為4.7的滅菌注射用水，攪拌30分鐘，將卵黃液轉入不銹鋼 桶中，加入終濃度為4％正辛酸，繼續攪拌30分鐘，室溫放置12～24小時，用 40目濾網撇去漂浮在上層的蛋黃，用80目濾布過濾，收集濾液，濾出液和下層 液體合并，用板框過濾器加濾板和0.4微米濾膜過濾，然后轉入用0.2％甲醛溶 液消毒的500L冰柜中，4℃冷藏5小時，使殘留的辛酸結晶凝結析出，用80目 濾網撇去浮在上層的辛酸結晶，用0.2M氫氧化鈉溶液調pH7.0，再后用磷酸氫 二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液調節pH6.9，即為抗體半成品。

進一步，抗體半成品加入終濃度0.05％甲醛，用過濾精度0.2μm的筒式濾 芯過濾除菌。