[發(fā)明專利]一種高效表達(dá)海腎熒光素酶基因的產(chǎn)品及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610161616.6
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105671006B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚文杰;申梁
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/62;C12Q1/02
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)海腎熒光素酶基因的能夠用于高通量篩選抗冠狀病毒藥物的產(chǎn)品及其應(yīng)用。本發(fā)明首先通過重疊PCR方法將海腎熒光素酶基因以替換或者插入到附屬基因(ns2和ns12.9)中的方式克隆到人冠狀病毒OC43全長感染性克隆pBAC?OC43^FL中，獲得了四種高效表達(dá)海腎熒光素酶基因的能夠用于高通量篩選抗病毒藥物的產(chǎn)品：rOC43?ns2DelRluc、rOC43?ns2FusionRluc、rOC43?ns12.9StopRluc和rOC43?ns12.9FusionRluc。其中rOC43?ns2DelRluc能夠高效表達(dá)海腎熒光素酶基因，插入的報(bào)告基因在連續(xù)傳代過程中較為穩(wěn)定，并且能夠成功應(yīng)用于抗病毒藥物篩選實(shí)驗(yàn)，在高通量篩選抗冠狀病毒藥物和宿主抗病毒基因等方面有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及人冠狀病毒OC43重組病毒，尤其涉及一種高效表達(dá)海腎熒光素酶基因的人冠狀病毒OC43重組病毒，本發(fā)明還涉及該OC43重組病毒在抗冠狀病毒藥物篩選實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，屬于表達(dá)海腎熒光素酶基因的人冠狀病毒OC43重組病毒的拯救和應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù) 人冠狀病毒OC43(Human coronavirus OC43，HCoV-OC43)是目前已知的6種人冠狀病毒中的一種，該病毒最早發(fā)現(xiàn)于1967年美國馬里蘭州貝塞斯達(dá)市，從一名上呼吸道感染患者中分離獲得。據(jù)報(bào)道約有5％～20％的人呼吸道感染是由HCoV-OC43引起的，人感染 HCoV-OC43后一般會出現(xiàn)上呼吸道感染的臨床特征，如鼻炎、咽炎和喉痛等，但是越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，HCoV-OC43會使免疫功能低下的人群，如嬰幼兒和老年人表現(xiàn)出支氣管炎、肺炎等嚴(yán)重的下呼吸道癥狀。最近，隨著研究的深入，病毒學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)HCoV-OC43具有嗜神經(jīng)性，在患有急性弛緩性麻痹病例患者的鼻咽拭子中檢測到了HCoV-OC43和HCoV-229E病毒的共感染。HCoV-OC43屬于β群，同屬于該群人冠狀病毒的還有HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV，其中2003年爆發(fā)的SARS-CoV和2012年9月在沙特地區(qū)爆發(fā)的MERS-CoV都能夠引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。針對這6種人冠狀病毒，特別是2種新型冠狀病毒，目前尚無特效藥和疫苗，因此構(gòu)建一株能夠用于高通量篩選抗人冠狀病毒藥物的重組病毒迫在眉睫。

HCoV-OC43與其它冠狀病毒相似，是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約31 kb。冠狀病毒基因組RNA具有和真核生物mRNA一樣的5′端甲基化帽子結(jié)構(gòu)和3′端的多聚賴氨酸尾巴。基因組RNA的5′端是一段由65至98個(gè)堿基組成的“前導(dǎo)序列”，緊接著“前導(dǎo)序列”的是一段由200-400個(gè)堿基組成的“非翻譯區(qū)”(untranslated region，UTR)，在基因組的3′端也有一段由300至500堿基組成的“非翻譯區(qū)”，這兩個(gè)“非翻譯區(qū)”的功能目前還不是很清楚，可能與冠狀病毒基因組包裝信號有關(guān)。冠狀病毒基因組5′端到2/3處的兩個(gè)開放閱讀框ORF1a和 ORF1b負(fù)責(zé)編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮了重要作用。其中nsp5是主要的蛋白酶，在眾多冠狀病毒中nsp5蛋白的單體結(jié)構(gòu)均顯示出較高程度的結(jié)構(gòu)保守性，這也使得設(shè)計(jì)或篩選光譜抗冠狀病毒藥物成為可能，該蛋白也是第一個(gè)用于設(shè)計(jì)針對冠狀病毒廣譜抑制劑的蛋白。此外，HCoV-OC43基因組與同屬于β群的SARS-CoV和 MERS-CoV具有極高的基因組相似性，特別是在ORF1b的復(fù)制酶(nsp12)和解旋酶(nsp13) 區(qū)域，這兩個(gè)蛋白同樣也成為了研究抗冠狀病毒藥物的靶點(diǎn)。因此，以HCoV-OC43作為冠狀病毒模型可以不依賴于BSL3實(shí)驗(yàn)室，并用來研究冠狀病毒復(fù)制，病毒編碼蛋白的功能和篩選新型抗冠狀病毒藥物等。