[發明專利]早實枳miR172家族基因的分離及在植物成花調控中的應用

在審

• 申請號: 201610161255.5
• 申請日: 2016-03-21
• 公開（公告）號: CN107217053A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 張金智;侯小進;胡春根;呂璐怡
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及早實枳miR172家族基因的分離及在植物成花調控中的應用。本發明分離到早實枳miR172基因家族中的3個成員，分別命名為PtmiR172a、PtmiR172b和PtmiR172c，它們的核苷酸序列依次為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，長度分別為212bp、305bp和298bp。遺傳轉化煙草后，PtmiR172a、PtmiR172b和PtmiR172c均明顯地縮短了煙草的營養生長期，促進煙草早花。這些基因對于加快多年生木本果樹的育種和遺傳改良將發揮重要的作用。

背景技術

開花結實是植物生命周期中重要的生物學過程，是植物自身發育過程的中心環節，也是果樹生產及果業產品加工的基礎。大部分的木本果樹均為多年生的植物，從種子播種、萌發到具備正常的開花能力，需要經歷一個漫長的階段，即童期(Cervera et al.1998)。不同種類的果樹童期長短不同，桃三李四橘八年，而像銀杏等實生繁殖樹從播種到開花則需更長時間(Pena et al.2001)。木本果樹一般體積大、遺傳背景復雜、童期相對較長等原因，很大程度上制約了多年生果樹，尤其是以收獲生殖器官為主的果樹和經濟林木的育種進程及新品種的推廣。因此，揭示木本植物從營養生長到生殖生長轉變的分子機制，對于果樹品種改良及花期調控有著重要的理論意義和實踐價值。

植物成花是其成功進入生殖階段的標志，目前在擬南芥中發現有五條主要調控植物成花的途徑：光周期途徑、春化途徑、GA途徑、自主途徑和年齡途徑(Khan et al.2014)。microRNAs(miRNAs)是一類大小只有21-24nt的單鏈小分子RNA，是動植物中最重要的基因表達調控因素之一，通過特異地降解或者抑制靶基因的翻譯來調控基因的表達(Nozawa et al.2012)。近年來的研究發現，miR156和miR172在植物由營養生長向生殖生長的轉變期扮演著關鍵的角色，二者可以靶定目標基因的DNA轉錄因子起作用(Lauter et al.2005)。miR156在植物幼年期呈現很高的表達量，在進入成年期后含量逐漸降低，而miR172有著相反的表達模式(Fornara et al.2009)，這表明miR156和miR172有著互補的調節關系。miR156的過表達可以對SPL基因造成負調控作用，推遲幼年期向成年期和成年期向生殖期的轉變(Khan et al.2014；Wu et al.2009)。SPL基因是多個成花信號調控并形成年齡成花途徑的分子輸出通道(Wang et al.2009)。在擬南芥中，miR172對成花的調控機制已有較多報道，主要通過調控AP2和AP2-like基因的轉錄水平來調節植物的成花(Mathieu et al.2009)，而在木本植物中，miR172的調控作用還不完全清楚。

miR172除了調控植物的成花時間，對植物的花器官形成也有一定的影響。擬南芥的花朵有四輪花器官，從外到內依次是萼片(第一輪)、花瓣(第二輪)、雄蕊(第三輪)和雌蕊(第四輪)。花器官的形成由A、B和C三類基因進行調控(Causier et al.2010)。AP2屬于A類基因，它特異調控第一輪花器官萼片的生長，并與AP3和PI共同調控第二輪花器官花瓣的生長(Wollmann et al.2010)。AP2是miR172的靶基因，miR172可以通過調節AP2的表達來對花器官的形成進行控制，miR172該部分的作用已有實驗進行證實。

miRNA在植物的整個生長發育過程中都有著重要的作用，其中miR172在植物的成花過程中是年齡途徑中的重要控制基因，miR172在擬南芥中的作用機理目前已經研究的較為透徹，但關于miR172在木本植物中對成花的研究卻不是很多。柑橘作為世界上第一大果樹，有著重要的經濟價值，但其童期長(從栽植到第一次開花的時間)且大部分品種一年成花一次，嚴重制約了其育種進程。本申請人所在的華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室在前期研究中發現普通枳的早花突變體早實枳(Ai et al.2012；Li et al.2010；Zhang et al.2011)，它的童期只有一至兩年，而且可以一年多次成花。早實枳的發現為研究柑橘一年多次成花的機理提供了良好的材料。

發明內容