[發明專利]一種針對沙門氏菌的檢測方法

有效

• 申請號: 201610157051.4
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105823876B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 許恒毅;熊勇華;黃小林;賴衛華;熊穎;梁毅
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，進一步涉及基于ELISA的抗原檢測技術，具體涉及一種針對沙門氏菌的檢測方法。

背景技術

沙門氏菌(Salmonella)為革蘭氏陰性短桿菌，無莢膜和芽孢，大部分屬于需氧，小部分兼性厭氧菌，有鞭毛；生長溫度范圍廣，可在10-42℃條件下生長，最適溫度為37℃，最佳pH6.8-7.8；沙門氏菌分布廣，是引起食物中毒的重要病原菌，很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑傳播，沒無中間宿主，能引起人和動物傷寒、副傷寒和食物中毒，導致腸熱癥、敗血癥和胃腸炎三類疾病。近年來，由于環境污染的加劇及食品生產流通的全球化，食品在從原材料到生產、運輸、銷售的各個環節都極易受到細菌污染，造成細菌性食物中毒，每年由沙門氏菌引起的食物中毒病例多達幾千萬，造成很大的健康危害和經濟損失。在各類細菌性的食物中毒中,沙門氏菌食物中毒位居前列。在我國，沙門氏菌引起的食物中毒占首位，沙門氏菌食物中毒和動物感染沙門氏菌十分嚴重，已引起各界學者的廣泛重視。

現有技術中，檢測沙門氏菌常用方法包括傳統檢測方法、以分子生物學為基礎的檢測方法以及免疫學為基礎的檢測方法三大類。常用傳統檢測方法需要預增菌，選擇性增菌，分離培養以及生化鑒定四個步驟。其結果準確、可靠的，但需經過預增菌以及生化試驗等一系列復雜繁瑣的操作，檢測周期一般需要4-7天才能完成。因此，傳統的檢測技術已無法滿足對食品中沙門氏菌的快速檢出。以分子生物學為基礎的檢測方法包括核酸探針技術，PCR技術以及基因芯片技術等技術；盡管該類方法具有靈敏度高等特點，但需依賴于昂貴的儀器設備和熟練的操作人員，且需復雜的樣品前處理，因此無法滿足基層及現場實地監控的需要。免疫學方法主要包括直接免疫熒光(IFA)法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫磁性分離(IMS)、乳膠凝集試驗等，該類方法基于免疫學的快速篩查，具有通量高、檢測快速、價格便宜等優勢，近年來得到了大量的推廣和應用。特別是，酶聯免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、靈敏、特異、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測等優點，已成為沙門氏菌快速篩查檢測的主要方法。然而，現有技術中檢測沙門氏菌的ELISA方法普遍基于辣根過氧化物酶標記的抗體或抗原催化雙氧水生成羥自由基，進而氧化無色的化學顯色底物四甲基聯苯二胺(TMB)形成藍色產物，然后使用終止液(2M H₂SO₄)終止反應形成黃色溶液于450nm處記錄吸光度值。該類方法因其顯色強度較低，因此檢測靈敏度相對較低，當待測樣品中目標物含量較低時易出現假陰性結果，從而無法滿足實際應用的要求。

近年來，一些新型的信號傳導機制被報道用于替代傳統ELISA的信號傳導機制用于提高ELISA的靈敏度，如放射免疫分析底物、化學發光底物、熒光底物以及共振膠體金溶液等。然而，發光體系的構建需要充分考慮被檢測對象的分子生物學性質，例如在方法層面，抗體的包被及其與抗原的結合性能，選用何種標記物酶及其與抗體的偶聯方法，顯色底物的選擇以及具體發光方法；在效果層面，既要保證顯色反應的靈敏性，又應滿足顯色強度與目標物含量的線性關系。因此，針對沙門氏菌的ELISA檢測方法，尤其以提升其檢測靈敏性為目的的方法改進，具有突出的技術難度。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種針對沙門氏菌的檢測方法，以解決現有技術的沙門氏菌ELISA檢測方法精度較低。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術用于沙門氏菌抗原檢測的ELISA方法中，標記抗體的酶靈敏性較低。

本發明要解決的再一技術問題是現有技術用于沙門氏菌抗原檢測的ELISA方法中，顯色系統靈敏性較低。

本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶C100作為抗體標記酶對沙門氏菌抗原執行ELISA檢測時，具體工藝方法并不明確。

本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶C100作為抗體標記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點作為底物對沙門氏菌抗原執行ELISA檢測時，檢測結果與抗原濃度的線性關系不佳。

本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶C100作為抗體標記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點作為底物對沙門氏菌抗原執行ELISA檢測時，過程中洗滌效果不佳。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：