[發明專利]一種禽流感病毒效價的測定方法

在審

• 申請號: 201610155426.3
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105586440A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 王玉玲;黃金妹;韋姜玲;許必釗
• 申請（專利權）人: 福州大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種禽流感病毒效價的測定方法。

背景技術

禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）是嚴重危害家禽和野禽的一種烈性傳 染病原，有可能引起全球的流感大流行，是威脅我國養禽業的最重要的疫病之一。目前疫苗 免疫是降低發病率和死亡率的最主要的方法，在常規的禽流感疫苗生產過程中，雞胚是禽 流感病毒最為常用的一種培養基質，但用雞胚尿囊液制備抗原過程中禽流感病毒易引起抗 原性變異；大規模生產時還存在雞胚數量不足和潛在外源病毒污染的問題，尤其在禽流感 爆發時。因此為了克服這些局限和不足，急需要利用哺乳動物細胞為基質制備的疫苗，這樣 的疫苗具有無外源因子污染、易于規模化生產、可以較好的維持病毒抗原穩定等特點。

目前我國對于禽流感病毒的效價測定方法為利用雞胚培養后測定血凝效價，計算 EID50，該種方法因使用雞胚而受到一定的限制，如夏季高溫對長途運輸的雞胚質量造成一 定的影響，雞胚中可能存在外源性病原污染等，這些都會導致效價測定結果不穩定或不準 確。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種提高測定結果的準確性與穩定 性的禽流感病毒效價的測定方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種禽流感病毒效價的測定方法，包括以下步驟：

1)細胞傳代：將處于細胞對數生長期的MDCK細胞進行傳代培養，并使細胞密度為1-2 ×10⁵個/ml，然后將MDCK細胞鋪到細胞培養板上，每孔100μL，并將細胞培養板置于溫度37 ℃、CO₂濃度為5%的培養箱中培養28-30h；

2)稀釋樣品：將禽流感病毒液用DMEM培養液進行10倍倍比稀釋，得到不同稀釋度的禽 流感病毒液，備用；

3)洗板：將上述步驟1）長滿MDCK細胞的細胞培養板中的細胞培養液棄去，用0.01mol/L 的磷酸鹽緩沖液洗滌3次；

4)加液：在細胞培養板上設樣品組和對照組，樣品組每孔加入0.1ml含胰酶的DMEM培養 液，對照組每孔加入0.2ml含胰酶的DMEM培養液，所述DMEM培養液中胰酶的質量濃度為50μg /ml；然后將細胞培養板置于35℃環境中孵育15min；

5）接毒：取上述步驟2）適當稀釋度的禽流感病毒液接種細胞，每個稀釋度接種5孔，每 孔0.1ml；

6）培養：將步驟5）得到的細胞培養板置于35℃、CO₂濃度為5%的培養箱中培養100- 120h；

7）測定病毒效價：觀察細胞培養板中的細胞病變情況，使用Reed-Muench方法計算 TCID₅₀值，測定病毒效價。

本發明細胞病變的判定方法為：當細胞孔內100%細胞發生病變判定為有病毒感 染，計入細胞發生CPE數，根據觀察到的細胞培養板中的細胞病變情況（即細胞發生CPE數）， 使用Reed-Muench方法計算TCID₅₀值。

本發明所述TCID50的計算方法按照《中華人民共和國獸用生物制品規程》中病毒 半數致死（感染）量（LD₅₀、EID₅₀、TCID₅₀）的測定方法。

所述細胞培養板為96孔細胞培養板。

所述DMEM培養液為DMEM培養基用超純水配制而成，并調節pH至7.4。所述DMEM培養 基為CIBCO公司生產。

本發明采用以上技術方案，通過對MDCK細胞進行傳代鋪細胞板，接種不同稀釋度 的禽流感病毒，一定溫度下培養一定時間，通過觀察細胞病變計算病毒的含量。本發明方法 因使用細胞測定，測定結果穩定，因排除了細胞株的外源性病源污染，使測定結果更準確。

發明專利（CN102703602B）公開了一種重組禽流感細胞源滅活疫苗抗原病毒含 量的測定方法相比，本發明與該發明專利相比具有以下優點：

1、本發明的操作步驟中具體限定了接毒前的細胞處理，其中加入含胰酶的DMEM培養液 35℃處理15min，該步驟更利于禽流感病毒在MDCK細胞上的增殖，使發生病變的細胞孔可達 到100%病變。