[發明專利]一種微生物胞外多糖及其制備方法

有效

• 申請號: 201610144414.0
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105647990B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 劉建軍;趙祥穎;田延軍;趙晨;張家祥;王曉霞
• 申請（專利權）人: 山東省食品發酵工業研究設計院
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 張勇

1.一種微生物胞外多糖的制備方法，包括：

1)利用保藏編號為CCTCCNo:M2016035的假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發酵至發酵液呈凝膠狀，得胞外多糖發酵液；

2)將步驟1)得到的胞外多糖發酵液加水稀釋，離心，收集上清液，真空濃縮至原體積，加乙醇進行醇沉，收集沉淀干燥后即獲得胞外多糖粗品；

3)取步驟2)制取的胞外多糖粗品，加緩沖液分散，經DEAE-Sepharose FastFlow離子交換柱分離，得到EPSI和EPSII兩個組分，分別收集EPSI和EPSII適當濃縮后再分別用葡聚糖凝膠G-100柱層析，獲得SFEP-01菌株胞外多糖組分EPSI和EPSII純品；

步驟1)中假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發酵的方法包括步驟如下：

①將假單胞菌SFEP-01接種于新鮮斜面菌種培養基上，25-30℃培養1-2天得活化菌體；

②將步驟①制得的活化菌體接種于液體種子培養基中，25-30℃培養8-24小時，得種子液；

③將步驟②制得的種子液接種至發酵培養基，25-30℃發酵48－72小時至發酵液呈凝膠狀，得胞外多糖發酵液。

2.根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，斜面菌種培養基為(g/L)：葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化鈉2-5，瓊脂粉15-20，pH值調至7.0-7.2；

液體種子培養基為(g/L)：碳源10-60，酵母浸粉3-6，氯化鈉2-5，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2，調整pH值7.0-7.2；

發酵培養基為(g/L)：碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化鈉5-8，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2，調整pH值7.0-7.2。

3.根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，液體種子培養基和產胞外多糖發酵培養基中，碳源可選甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、檸檬酸鹽。

4.根據權利要求3所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，所述碳源為甘油。

5.根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，步驟2)中，發酵液加水稀釋10-50倍，4000-8000r/min離心10-20min，收集上清液然后再40-60℃濃縮至原發酵液體積，加入1-3倍無水乙醇，充分混勻，靜置沉淀，然后再經3000-5000r/min離心或過濾收集沉淀，低溫干燥或冷凍干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。

6.根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，胞外多糖粗品，加300-500倍緩沖液溶解分散形成膠體溶液；

DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱分離條件為：將離子膠DEAE-SepharoseFastFlow濕裝柱，用0.05mol/L、pH為7.6的Tris-HCl溶液平衡，將粗多糖樣品用0.05mol/L、pH為7.6Tris-HCL緩沖液溶解分散溶解后上樣，用1.2mol/L的氯化鈉溶液進行線性梯度洗脫，洗脫的流速為1-1.5BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，繪制洗脫曲線，合并單一峰收集管，透析、濃縮用于后續分離；

葡聚糖凝膠G-100柱分離條件為：將葡聚糖凝膠G-100濕裝柱，用0.05mol/L、pH為7.6的Tris-HCL溶液平衡，將DEAE-SepharoseFastFlow分離的單一組分濃縮上樣，用相同的緩沖液洗脫，洗脫流速1-2BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖含量高的收集管，透析、濃縮、干燥。

7.根據權利要求1-6任一項制備方法制備得到的胞外多糖。